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合成群落控制枣果实采后黑斑病的效果及其抑菌机制研究

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合成群落控制枣果实采后黑斑病的效果及其抑菌机制研究

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：蔡蜨张鸿雁雷兴梦曾凯芳西南大学食品科学学院国家柑桔工程技术研究中心

为了构建能够有效控制枣果实采后黑斑病的合成群落,分析***处理后枣果实表面附生微生物群落结构变化发现,***可降低Alternaria、Penicillium、Fusarium和Botrytis等病原真菌丰度,增加Pantoea、Bacillus、Staphylococcus、Pseudomonas等有益菌的丰度从而降低枣果实采后腐烂率。本研究从枣果实表面微生物群落的丰度、相关性、可培养性、菌株间的相互作用以及功能性出发,构建了***与7株细菌组成的合成群落,通过控病效果实验,进一步简化为***与6株细菌(Bacillus subtilis、Bacillus velezensis、Staphylococcus arlettae、Staphylococcus gallinarum、Pseudomonas sp.、Pseudomonas psychrotolerans)。果实损伤接种试验结果表明,***与6株细菌组成的合成群落较单株菌单独使用能显著降低枣果实采后黑斑病的发病率和病斑直径,在贮藏的第10d,发病率比对照组降低了69.23%,比***处理组降低了52.94%。研究合成群落抑菌机制发现,6株细菌与***组成的合成群落能够产生抑菌代谢产物、β-1,3葡聚糖酶以及VOCs等抑制Alternaria alternate的生长,除此之外,还能够通过诱导枣果实抗病性来控制冬枣采后黑斑病的发生,相比单一菌株具有更多样化的作用机制。综上所述,本研究为果蔬采后病害防控提供了一种新的视角和方法。

关键词：合成群落冬枣黑斑病机制研究

来源： cnki会议评论

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微生物组技术在果蔬采后领域中的研究进展

食品科学 2022年第3期43卷 286-295页

作者：张鸿雁雷兴梦荆佳伊邓丽莉易兰花曾凯芳西南大学食品科学学院重庆400715 西南大学食品贮藏与物流研究中心重庆400715

测序技术使研究不可培养微生物成为可能,该方法不仅可以获得研究对象的物种组成信息,还可以进一步研究功能基因层面的信息;常用的测序方法包括扩增子测序和宏基因组测序。采后水果和蔬菜中掩藏了大量微生物,但大多数与农产品相关的微生... 详细信息

测序技术使研究不可培养微生物成为可能,该方法不仅可以获得研究对象的物种组成信息,还可以进一步研究功能基因层面的信息;常用的测序方法包括扩增子测序和宏基因组测序。采后水果和蔬菜中掩藏了大量微生物,但大多数与农产品相关的微生物研究都集中在少数几种病原菌或者单一的拮抗菌上,因而对果蔬中发现的微生物群落的多样性及其结构、影响因素知之甚少。由此,本文将对通过测序来评估果蔬上微生物群落结构的一些研究进行总结,并介绍了微生物组相关定义和主要测序方法;分析了微生物组测序技术在采后果蔬中的应用及相关研究进展;且在此基础上进一步总结目前微生物组技术在采后果蔬领域应用的限制因素,提出一些可能的研究方向,为采后果蔬微生物组的研究提供一定的理论依据。

关键词：微生物组分析流程果蔬采后合成群落病害防治

黄花蒿根系合成细菌群落抵御Globisporangium ultimum var.的机制

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黄花蒿根系合成细菌群落抵御Globisporangium ultimum var.的机制

作者：王玉贵州师范大学

学位级别：硕士

黄花蒿(Artemisia annua L.)是一种具有悠久历史的中药材,其青蒿素是一种具有高效、安全、无毒副作用的新型抗疟药物,可有效抑制疟疾发生。其鲜有病害的主要原因之一是由于其体内拥有丰富的抑菌活性内生菌。宿主植物与微生物群落的关联... 详细信息

黄花蒿(Artemisia annua L.)是一种具有悠久历史的中药材,其青蒿素是一种具有高效、安全、无毒副作用的新型抗疟药物,可有效抑制疟疾发生。其鲜有病害的主要原因之一是由于其体内拥有丰富的抑菌活性内生菌。宿主植物与微生物群落的关联可通过建立无菌宿主开始,然后通过接种明确的微生物群落来探究宿主─微生物之间的关系。因此,本论文通过建立黄花蒿的无菌苗体系,为研究黄花蒿与细菌群落的相互作用提供实验材料。将从根系分离纯化得到的内生细菌简化得到一个由8个菌株组成的细菌合成群落,该群落能显著抑制由Globisporangium ultimum var.引起的黄花蒿病害。而植物内生菌的主要接种源来自土壤,外源病原菌的胁迫下会导致植物宿主内生菌群落结构及多样性的改变,为进一步了解黄花蒿在病原菌胁迫下是如何选择土壤细菌,增强自身防御系统,因此,通过外源添加病原菌,盆栽回接法进行处理,再利用Illumina Miseq高通量测序技术分析外源病原菌干扰下的微生物细菌群落的变化,探究病原菌如何介导黄花蒿宿主在众多土壤微生物群落中选择有益细菌,深层次阐明黄花蒿鲜有病害的原因。结果如下:1.黄花蒿组织培养再生体系的建立。以黄花蒿茎尖作为外植体,消毒前用0.3%链霉素溶液浸泡外植体3 h,依次以75%乙醇处理30 s,0.1%Hg Cl消毒6 min后,接种在20 mg·L的柠檬酸培养基中的效果最佳,污染率为25.7%,死亡率为8.6%,褐化率为22.4%;以MS培养基+1.0 mg·L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+0.1 mg·Lα-萘乙酸(NAA)+20 mg·L柠檬酸+0.2 g·L活性炭为最佳初代培养基,出愈率达96.9%,出芽率达93.8%;以MS培养基+0.5 mg·L NAA+0.1 mg·L 3-吲哚乙酸(IAA)+0.2 g·L活性炭为最佳继代培养基,生根率达95.0%;幼苗在移栽前先在室内开盖炼苗4～5 d,栽种在腐殖土中可获得100.0%的存活率。2.黄花蒿内生真菌和内生细菌的分离及筛选。在黄花蒿的叶片中共分离纯化得到3株内生真菌,其致病力为***>Fusarium tricinctum>Cerrena unicolor,并以***作为后续实验病原菌;从黄花蒿的根系中共分离纯化得到60株内生细菌,属于18个不同的属,其中6株对***具有抑制效果,表现为Rhizobium pusense(N26)>Paracoccus sp.(N21)>Flavobacterium sp.(N58)>Brevundimonas sp.(N16)>Stenotrophomonas sp.(N22)>Bacillus sp.(N31),这6个菌株组装在一起为C6细菌群落;另外,有2株对***具有很强的抑制作用,表现为Brevibacillus nitrificans.(N49)>Cupriavidus sp.(N56),与以上6株内生细菌组装为C8细菌群落。3.黄花蒿根系细菌菌落的组装及抗病效果。(1)细菌群落的组装。C6细菌群落虽能延缓由***引起的黄花蒿病害,但最后所有植株依然会感病,而在C6细菌群落的基础上添加N49、N56后,相比C6细菌群落,感病植株显著减少73.3%,说明N49、N56对增强C8细菌群落的防御系统起关键作用,因此,C8细菌群落优于C6细菌群落。(2)组装细菌群落对***的抑制作用。仅接种***的土壤表面聚集大量的白色棉絮状菌丝,黄花蒿幼苗全株枯黄、根系腐烂而死,死亡率和致病率高达100.0%,***与C8细菌群落共同接种的土壤表面的菌丝明显减少,大部分植株生长正常,干枯发黄症状得到改善,致病率、死亡率分别显著降低至26.7%、11.1%。(3)组装细菌群落对黄花蒿的生长情况、生理生化、次生代谢的影响。相比不接种任何微生物,仅接种***的黄花蒿生长受到显著抑制,其干重、鲜重、株高、根长分别显著下降350.2%、189.3%、153.9%、40.3%,因遭受严重的胁迫,导致超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸含量分别显著增加22.9%、1019.2%、112.9%,青蒿素、东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素的含量全因植株生长状态不佳分别显著下降306.6%、216.4%、332.6%、115.8%;相比仅接种***,***与C8细菌群落共同接种的黄花蒿干重、鲜重、株高、根数、根长分别显著增加21.7%、28.6%、182.4%、279.4%、172.3%。因受胁迫程度降低使得SOD、POD活性、脯氨酸含量分别显著降低42.1%、68.7%、71.8%,生长状况的改善使得青蒿

关键词：黄花蒿组织培养内生菌合成群落抗病机制

适盐异养硝化-好氧反硝化脱氮特性及群落构建

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适盐异养硝化-好氧反硝化脱氮特性及群落构建

作者：陈昊山东大学

学位级别：硕士

海水在工业、养殖业和日常生活中的广泛使用,使得大量含盐废水产生,盐度高达15-45 g/L,占全球废水总产量的5%。含盐废水通常伴随着氮素污染等问题,易引起自然水体的富营养化,严重破坏生态平衡,威胁人类健康。生物法因其能源资源消耗少... 详细信息

海水在工业、养殖业和日常生活中的广泛使用,使得大量含盐废水产生,盐度高达15-45 g/L,占全球废水总产量的5%。含盐废水通常伴随着氮素污染等问题,易引起自然水体的富营养化,严重破坏生态平衡,威胁人类健康。生物法因其能源资源消耗少、不易产生二次污染等优点,被广泛用于氮素污染的治理。传统生物脱氮方法中硝化细菌与反硝化细菌的代谢特性和环境条件适应性存在差异,增加了人工调控难度和运行成本。异养硝化-好氧反硝化(Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification,HN-AD)过程的提出,使得在单一构筑物中进行含盐废水氮素污染处理并实现同步硝化反硝化成为可能。目前,关于异养硝化-好氧反硝化的研究主要聚焦于功能菌株的筛选及脱氮特性的探索,对于其脱氮机理的研究较为局限,脱氮通路的假设证据不足。部分HN-AD功能菌株世代时间长,脱氮效率低,在水体中大多呈悬浮状态生长,在污水的连续流处理中易流失,需要额外固定化处理。针对HN-AD纯培养菌株在微生物群落的合成和构建方面的研究存在一定空白。本研究针对上述问题,在实验室丰富的海洋菌种资源库中筛选出了原生耐盐的高效异养硝化-好氧反硝自絮凝菌株,探究了其在不同盐度、温度、pH、碳源、C/N以及在Pb2+、Cd2+胁迫下的脱氮特性,讨论了菌株对复杂环境的适应性,优化得到了上述菌株的最适脱氮条件。在宏观物质和分子生物学、遗传学等维度,证明了关于HN-AD脱氮通路的假设。基于菌株高效异养硝化-好氧反硝化的脱氮性能、盐度耐受性以及自絮凝特性自下而上地合成构建了异养硝化-好氧反硝化微生物组,监测其在SBR反应器中对模拟含盐污水的处理效果及群落结构变化。本文主要研究内容与结论如下:本研究从海底沉积物中筛选出了两株具有高效异养硝化-好氧反硝化潜力的菌株,鉴定为 Acinetobacter johnsonii 2-1-H 和 Pseudomonas kunmingens 8-C。其中 *** 2-1-H具有较短的世代时间,*** 8-C具有自絮凝特征和良好的沉降性能。菌株*** 2-1-H的最适盐度范围3%-8%,温度耐受范围15℃-35℃,pH适应范围7-9,无水乙酸钠是其最佳碳源,最佳C/N为10,对低于20mg/LPb2+和低于10 mg/L Cd2+有一定耐受性;菌株P.8-C的最适盐度范围3%-8%,温度耐受范围15℃-35℃,pH适应范围7-9,无水乙酸钠是其最佳碳源,最佳C/N为7.5,对低于20 mg/LPb2+和低于10 mg/LCd2+有较好的耐受性;15N稳定同位素示踪结果说明了菌株*** 2-1-H和*** 8-C异养硝化-好氧反硝化过程得最终产物是N2;全基因组测序结果显示,两株菌的基因序列中分别包含11种与氮代谢相关的酶编码基因,它们包括:nxrAB、glnA、glt1、narGHI、napAB、nirK、nirS、norBC、nosZ、nirBD、nasAB;PCR 结果证明,amoA 和 hao 基因在*** 2-1-H和*** 8-C中实际存在,但丰度较低,推断出还存在其它与NH4+-N去除相关的酶与AMO、HAO一起协同催化该过程。两种HN-AD脱氮通路在菌株*** 2-1-H和*** 8-C 中共存,具体路径如下:(1)NH4+-N→NH2OH→NO→N2O→N2;(2)NH4+-N→NH2OH→NO2--N→N03--N→NO2--N→NO→N2O→N2。由菌株*** 2-1-H和*** 8-C合成构建的HN-AD微生物组处理效果稳定,40天内,SBR反应器NH4+-N去除率为92.92±1.19%,TN去除率为87.65 ±1.78%,N02--N和N03--N积累量少。对照组水质波动较大,40天内NH4+-N去除率仅为14.43±7.50%。实验组微生物群落丰富度和多样性较高,发展成为了较为稳定的群落,自絮凝菌株*** 8-C的成膜能力为稳定而多样的微生物组的合成提供了条件。本研究丰富了异养硝化-好氧反硝化脱氮微生物菌种资源,为HN-AD代谢机理及脱氮通路提供了更加充分的证据,探索了菌株在模拟含盐污水连续处理中的可行性,在高盐污水氮素污染治理领域具有广泛的应用前景。

关键词：高盐废水异养硝化-好氧反硝化自絮凝脱氮通路合成群落

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土壤微生物介导植物抗盐性机理的研究进展

中国农业科学 2021年第10期54卷 2073-2083页

作者：孔亚丽朱春权曹小闯朱练峰金千瑜洪小智张均华中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室蚌埠市亿丰生物有机肥有限公司

土壤盐渍化是农业可持续生产面临的严重威胁之一。利用高效、低成本和适应性强的方法对盐渍区进行修复是一个具有挑战性的目标。土壤微生物在调节植物根际环境、调控生长发育和提高系统生产力等方面具有重要作用。近年来,由微生物驱动... 详细信息

土壤盐渍化是农业可持续生产面临的严重威胁之一。利用高效、低成本和适应性强的方法对盐渍区进行修复是一个具有挑战性的目标。土壤微生物在调节植物根际环境、调控生长发育和提高系统生产力等方面具有重要作用。近年来,由微生物驱动的植物胁迫耐受性受到了广泛关注。通过识别和利用能与植物相互作用的土壤微生物来减轻盐胁迫,为盐渍区改良提供了一种新策略,也为与胁迫耐受相关新机制的发现开辟了新途径。了解不同微生物介导的胁迫耐受性的潜在生理机制对有效利用这些微生物促进农业可持续生产至关重要,本文从植物养分吸收、渗透平衡、激素水平、抗氧化功能等方面论述了国内外关于土壤微生物介导植物耐盐性的作用机理,评估了目前关于土壤微生物参与调节植物耐盐性相关研究的有益作用和不足之处,提出了未来研究的发展方向。目前通过提高养分及水分吸收效率维持盐胁迫下植物离子稳态,提高生长素的合成、降低乙烯的释放调控植物激素水平是土壤微生物改良植物耐盐性的目标过程,然而单个外源微生物接种时会与土著微生物组竞争,导致许多微生物菌株不能在土壤或植物根系中定殖或存活,致使微生物在大规模农业生产应用中仅取得了有限的成功。未来微生物介导植物抗盐性的研究应突破单一微生物接种的研究方式,进一步在群落水平上阐明植物-微生物的相互作用介导植物抗盐性的机制,解决农业微生物利用的关键问题。

关键词：盐胁迫土壤微生物根际促生细菌丛枝菌根真菌内生菌合成群落植物耐盐性

枫香拟茎点霉B3诱导的花生核心功能细菌组合的促生抗病功能研究

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枫香拟茎点霉B3诱导的花生核心功能细菌组合的促生抗病功能研究

作者：马晨雨南京师范大学

学位级别：硕士

花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的粮油与经济作物。随着需求的不断提升,连作是花生目前普遍采用的农业管理模式,然而这一种植方式会导致其发育受阻、病害爆发等问题的产生。本研究组前期研究发现的一株内生真菌枫香拟茎点霉B3能... 详细信息

花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的粮油与经济作物。随着需求的不断提升,连作是花生目前普遍采用的农业管理模式,然而这一种植方式会导致其发育受阻、病害爆发等问题的产生。本研究组前期研究发现的一株内生真菌枫香拟茎点霉B3能够缓解花生连作障碍,提高连作花生的产量,降低土传病害发生。然而,B3的促生抗病机制仍不清晰。前期的研究指出B3能够促进花生-根瘤菌共生体系的建立,并影响根瘤内细菌群落组成。然而,B3定殖诱导的根内生细菌群落是如何变化的以及这种变化是否影响了花生的生长及抗病性仍不清楚。因此,本研究拟从内生细菌群落变化角度探究枫香拟茎点霉B3促进花生生长及抗病的机制。我们通过一季盆栽实验,设置连作(CM)、连作施加B3(CMB)以及非连作(NCM)三个处理,首先探究了连作条件下接种B3对花生株高、根长、地上组织鲜重及干重、地下组织鲜重及干重、结瘤数、荚果产量等农艺性状的影响。其次,调查统计了不同发育时期花生叶斑病、根腐病的发病率及病情指数,并定量了尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的相对丰度。随后,我们利用PCR-DGGE指纹图谱及BiologEco微平板对B3定殖引起的内生细菌群落变化进行了初步判断。结果表明:B3能够有效提高花生的株高、生物量及产量。与CM处理相比,CMB处理显著降低了苗期花生根腐病的发病率以及结荚期、成熟期时叶斑病的发病率。PCRDGGE及Biolog Eco结果表明,常年连作导致了内生细菌群落变化,而B3定殖改变了根内生细菌群落组成,增强了内生细菌的功能多样性。这些结果表明,B3能够很好的缓解连作导致的花生发育受阻和病害发生,并显著影响内生细菌的群落组成和功能。为了探究B3定殖引起的花生内生细菌群落的具体变化,并探究其诱导的核心微生物组,我们利用16S r RNA基因高通量测序方法,分析了内生真菌B3接种对不同时期花生根内细菌群落组成的影响,并结合纯培养的方法获得内生细菌分离株。结果表明,内生真菌B3改变了连作花生根内生细菌群落,提高了慢生根瘤菌属、链霉菌属的丰度。基于核心微生物的网络分析显示,链霉菌属、假单胞菌属、伯克霍尔德菌属为优势节点;同时,在纯培养水平上也体现出了内生真菌B3对连作花生根内生细菌群落的影响,芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属为可培养水平上内生真菌诱导的优势菌属。因此,结合高通量测序与纯培养结果,我们选定慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和类芽孢杆菌属(Paeniacillus sp.)为核心菌属。为了探究B3诱导的差异微生物群落是否能够促进连作花生健康生长,防控土传病害,提高花生产量,我们首先利用内生细菌分离株进行了优势细菌的筛选。随后,通过人工合成微生物组我们在无菌蛭石及连作红壤体系中探究核心功能细菌组合的抗病促生效果。通过对内生细菌分离株体内、体外促生抗病特性的评价,我们筛选出6株细菌进行组合回接实验,结果表明由Bacillus aryabhattai(S1),Bacillus megaterium(S2),Burkholderia cepacia(S3),Pseudomonas koreensis(S4),Bradyrhizobium yuanmingense(S5),Streptomyces diastaticus(S6)构成的核心功能细菌组合能够显著的促进连作花生的生长并限制病原菌丰度。综上所述,本文从内生细菌群落变化角度,分析内生真菌诱导的核心微生物,并筛选利用功能细菌组合,探究了枫香拟茎点霉B3促生抗病机理,为利用组合微生物进行绿色有效的农业管理提供理论基础。

关键词：花生连作障碍叶斑病根腐病合成群落内生细菌

大豆根际促生菌剂的菌株组合及土壤定殖载体研究

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大豆根际促生菌剂的菌株组合及土壤定殖载体研究

作者：邢鹏程西北农林科技大学

学位级别：硕士

植物根际微生物群落通过与植物的互作发挥着重要的生态功能。但目前对根际微生物群落的构建机制和功能仍不清楚,对根际微生物群落在植物生长时间序列上的演替方式及其对植物的影响研究较少。本研究基于前期通过培养组学技术分离获得的... 详细信息

植物根际微生物群落通过与植物的互作发挥着重要的生态功能。但目前对根际微生物群落的构建机制和功能仍不清楚,对根际微生物群落在植物生长时间序列上的演替方式及其对植物的影响研究较少。本研究基于前期通过培养组学技术分离获得的大量不同时期的大豆根际菌株,通过分析群落演替特征,筛选时序核心微生物,构建大豆根际不同时期的核心微生物合成群落。使用这些核心微生物群落开展植物接种试验,探究不同时期核心群落对大豆植物的影响,并分析了载体对群落稳定性的影响。结果如下1.通过对培养组获得的菌群进行数据分析,筛选出72个菌株组成时间序列核心微生物群落。通过对核心微生物群落进行分析,表明核心群落的阿尔法多样性和贝塔多样性在不同的处理样本上均能够与完整群落保持一致,核心群落的物种丰度则能够在整体群落上占绝大部分比例。共发生网络分析也显示了核心微生物在整体群落的联系中的确有重要的作用。核心群落在基于土壤测序数据的群落和基于培养组数据的群落中均具有较强的代表性。2.通过不同时期根际核心人工合成群落的植物接种试验,发现尽管各群落的物种组成相同,但其物种丰度的差异会对植物生长有显著影响,特别是w0菌群和w7菌群的影响更明显。进一步的转录组分析发现w0菌群使植株的光合作用上调,促进了植株生长,其接种的大豆植株干重较高。茉莉酸相关基因的上调体现了w0菌群诱导了茉莉酸介导的信号传导,可能诱导了植株的抗性,也表现了细菌与植株的互作。w7菌群上调了IAA合成相关基因,抑制了结瘤,促进了细胞壁合成,可能使得植物IAA浓度超过最佳水平,导致w7菌群接种植株干重较低。w7菌群接种使大豆植株脱落酸相关基因和蛋白磷酸化相关下调,可能表现了植株防御水平的下降。3.通过人工合成的均一化菌群接种载体试验,发现不同载体组合对群落的稳定性影响有较为显著的差异。均一化菌群结合载体的正交试验确定了凹凸棒土0.5m L,硅藻土1m L和玉米秸秆2m L为最优组合。本研究构建的人工合成根际微生物群落具有良好的代表性,通过对这些群落的研究揭示了大豆不同时期根际群落对植物影响的差异,探讨了不同载体对群落稳定性的影响,有助于后续微生物植物相互作用及根系分泌物的研究,也为后续的载体进一步优化提供了基础。

关键词：合成群落核心微生物群落转录组载体

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丹参根系培养放线菌组及其功能研究

丹参根系培养放线菌组及其功能研究

作者：吴玉瑞成都中医药大学

学位级别：硕士

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎,是临床常用于预防和治疗心血管疾病的重要药物。研究表明,内生菌能发挥调控丹参药材产量和质量的作用;放线菌是一类能赋予宿主植物有益性状的微生物,但丹参根系放线菌组... 详细信息

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎,是临床常用于预防和治疗心血管疾病的重要药物。研究表明,内生菌能发挥调控丹参药材产量和质量的作用;放线菌是一类能赋予宿主植物有益性状的微生物,但丹参根系放线菌组的组成及其功能尚缺乏系统的研究。本研究以四川中江道地产区丹参为研究材料,采用不同培养基分离、纯化并保存丹参根系放线菌。利用测序技术进行分子鉴定和宏基因组功能分析,并进行体外益生功能筛选。综合考虑菌株亲缘关系和功能特性构建5个合成放线菌群落,在1/2 N、1/2 P和1/2 Fe的Hoagland营养条件下考察这些群落对丹参生长发育、氮磷铁代谢、抗性和活性成分的影响。以解析丹参根系培养放线菌组的组成及其功能。本研究取得了以下结果:(1)丹参根系培养放线菌的种类和功能丰富多样。采用不同培养基从丹参根和根际土中共分离、纯化和保存了369株根系放线菌,经16S r RNA测序和序列比对归并为3科,4属,46种,72株;其中根内特有放线菌15种,根际特有14种,二者共有17种,均以链霉菌属为优势属。利用宏基因组测序技术从这些放线菌中获得了428014个非冗余基因,通过KEGG数据库注释了86.57%的基因,它们大多数与碳水化合物代谢途径相关;通过egg NOG数据库注释了77.36%的基因,主要参与转录以及碳水化合物的运输和代谢;通过CAZy数据库注释了5.87%的基因,主要是糖苷水解酶的类型。此外,注释到了链霉素、新霉素等抗生素合成相关的基因,以及植物激素、氮代谢、磷代谢、铁载体合成、抗病虫害等促生相关基因/酶。益生功能活性(PGP)测定表明,52株放线菌能在无氮培养基上生长,25株菌能产生铁载体,24株能溶解无机磷;37株可产生植物生长素,尤以菌株SA047的产量最高;其中有7株菌具有上述各项PGP功能。可见,丹参根系培养放线菌组的物种组成和功能丰富多样,为利用根系放线菌组改善丹参药材品质奠定了重要的数据和基础材料。(2)放线菌群落能调控丹参的生长发育。依据PGP菌株的亲缘关系和功能特性构建了5个合成放线菌群落,考察这些群落在1/2 N、1/2 P和1/2 Fe的Hoagland营养条件下对丹参生长发育的影响。结果表明5个合成放线菌群落均有促进丹参植株鲜重积累的趋势,其中有2个群落能显著提高丹参幼苗总鲜重,分别提高了30.3%和25.5%。丹参幼苗总鲜重与叶绿素含量、叶绿素荧光参数、氮代谢相关酶、酸性磷酸酶、高铁还原酶和抗氧化酶等指标的相关性分析表明,合成放线菌群落通过提高植物光合作用效率、养分吸收和利用效率以及提高植物抗性而促进植物生长。同时,依据PGP功能互补构建的群落较全功能菌株构建的群落益生作用更加明显。提示PGP功能互补是构建合成益生群落的良好策略。(3)放线菌群落能调节丹参次生代谢物的比例和含量。采用UPLC-MS/MS测定丹参根中8种活性成分的含量,考察接种合成放线菌群落对丹参次生代谢物的影响。结果表明,3个群落提高总酚酸类含量分别达31%、11%和6%,降低总酮类的含量分别达34%、37%和18%;1个群落提高总酚酸类和总酮类成分含量分别是18%和13%,1个群落降低总酚酸类和总酮类含量分别达3%和26%。丹参次生代谢物与合成群落结构关系的进一步分析表明,菌株之间的亲缘关系影响活性成分含量的效应较菌株功能更明显,菌株亲缘关系远的群落主导提高丹参总酚酸类成分含量的效应,亲缘关系近的群落主导调控丹参总酮类成分的效应。提示放线菌群落能够发挥调控丹参次生代谢物合成的作用。综上可见,本研究工作构建了丹参根系培养放线菌组菌株库,明确了丹参根系培养放线菌组的功能。通过合成PGP功能群落与丹参试管苗共培养,发现益生群落通过提高光合效率、抗性和矿质元素吸收和利用效率,而发挥调节植物生长发育的作用;进一步证实植物放线菌组能发挥调控药用植物药材产量、质量和减少肥料施用等有益作用。同时,本研究结果表明功能互补是构建人工合成益生群落的良好策略,也获得了能减少肥料施用并提高丹参产量和质量的最优群落。本研究构建了定向调控丹参药材品质的重要生物资源,为丹参药材生产定向调控提供了新思路和技术,也为理解植物微生物互作机理奠定了坚实的基础。

关键词：丹参根系培养放线菌物种组成功能分析合成群落

柑橘果实附生微生物群分析及对其采后病害的生物防治研究

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柑橘果实附生微生物群分析及对其采后病害的生物防治研究

作者：荆佳伊西南大学

学位级别：硕士

柑橘是我国重要的经济水果,其附生微生物群与果实健康及耐贮性密切相关,高通量测序技术的发展为同时研究可培养及不可培养微生物提供可能性,基于这种方法提供的丰富的微生物群落信息,可研究微生物群落的组装机制、微生物-微生物以及微生... 详细信息

柑橘是我国重要的经济水果,其附生微生物群与果实健康及耐贮性密切相关,高通量测序技术的发展为同时研究可培养及不可培养微生物提供可能性,基于这种方法提供的丰富的微生物群落信息,可研究微生物群落的组装机制、微生物-微生物以及微生物-宿主之间的相互作用关系等。柑橘果实采后极易受到病原菌侵染,造成巨大的经济损失,生物防治是控制采后病害的一种重要手段,然而单一拮抗剂在商业化过程中具有局限性,其控病范围较窄且效果不稳定,综合施用多种微生物可更有效地利用空间和营养,或可达到更好的控病效果。核心微生物群是指特定宿主中占有较大比重或有重要功能的一类微生物,它们通常与宿主健康密切关联。因此,本文以重庆市的柑橘果实为研究试材,通过宏基因组鸟枪法测序及扩增子测序方法,分析柑橘附生微生物群的结构与功能,探讨核心的附生微生物类群,同时分离纯化重要的微生物菌株,构建细菌合成群落,明确附生细菌群落对柑橘采后病害的控制效果,以期提供一种全新的采后病害控制方法。主要研究结论如下:1.蜜桔果实附生微生物群的结构与功能:(1)蜜桔果实附生微生物群中,真菌的相对丰度远高于细菌,但物种丰富度较低;细菌的相对丰度低,但其物种多样性更高,微生物类群分布更广。在门水平上,子囊菌门(82%)和担子菌门(14%)为真菌优势菌群,变形菌门(49%)、蓝藻门(23%)、硬壁菌门(7%)、拟杆菌门(7%)和放线菌门(6%)为细菌优势菌群。高丰度真菌大多数为病原菌,而高丰度细菌中含有大量具有生物控制潜力或促进植物健康的有益细菌。(2)根据GO数据库比对结果,ATP结合等与微生物定植及营养竞争相关的分子功能较为重要,跨膜运输等与抗病相关的生物过程也有较大贡献。根据CAZy数据库比对结果,CBM18、CBM50、GH19、GH18、GH13和GT2基因家族具有较高的相对丰度,超过已鉴定的CAZy家族总丰度的3%,它们多与果实健康及病害控制相关。根据CARD数据库比对结果,在门水平上蜜桔果实附生微生物中具有抗生素耐药性的微生物主要为子囊菌门(56.27%),变形菌门(21.49%),担子菌门(8.38%)以及蓝藻门(6.58%);而在目水平上,毛囊菌(24.00%),卡诺菌(16.09%),根瘤菌(10.56%)所占比例较高,这些微生物在作为生物防治剂使用时能够更好的适应环境压力,具有更高的稳定性,作为病原菌则会增加病害控制的难度。根据PHI数据库比对结果,共鉴别出3个病原菌中的10个基因,与果实和微生物互作相关,可作为抗病靶点。(3)基于蜜桔宏基因组鸟枪法测序分析结果,建立的物种与功能关联分析脚本,可为柑橘果实附生菌群的功能预测提供背景。2.不同品种柑橘果实核心附生微生物:(1)对丰脐、椪柑、蜜桔及柠檬果实附生微生物群进行了扩增子测序及分析,结果表明,丰脐和椪柑附生菌群具有较高的细菌多样性,而真菌多样性则在蜜桔和柠檬果实附生菌群中更高。虽然高丰度微生物在4个柑橘品种中均有分布,但不同品种果实附生微生物群落结构的组间差异显著大于组内差异。在门水平上,蓝藻细菌门、变形菌门和子囊菌门是柑橘附生菌群中的优势菌群。(2)基于韦恩图分析,在科水平上,α-变形菌等细菌以及虫囊菌纲等真菌为四个品种共有的高丰度微生物。在属水平上,不同柑橘品种的微生物相对丰度差异较大,丰脐和椪柑的微生物群落结构更为相似。基于相关性网络分析,在属水平上,不动杆菌等细菌以及Ceraceosorus等真菌与其它微生物成员相关性较强,对于维持群落结构的稳定起着重要作用。根据LEf Se差异分析,在属水平上共有11个细菌与9个真菌在特定品种柑橘附生群落中被定义为生物标记物,即其相对丰度在特定组别显著高于其它组别。根据以上三项标准综合考虑,共有14个细菌(属)及10个真菌(属)被定义为柑橘果实核心附生微生物类群。3.细菌合成群落对柑橘果实采后绿霉病和酸腐病的控制效果:(1)从柑橘果皮分离培养鉴定得到115株细菌,根据核心附生微生物类群标准,共选择8株细菌构建人工合成群落。平板对峙实验中,仅1株细菌对柑橘采后绿霉病及酸腐病病原菌指状青霉及白地霉具有直接抑制效果。(2)细菌合成群落及其成员均能抑制绿霉病的发生,延缓病斑直径的扩展;单株细菌处理在后期对病害的控制效果减弱,与单株细菌相比合成群落效果最佳。细菌合成群落及其个别微生物成员能够抑制酸腐病的发生,延缓病斑直径的扩展,一些微生物成员单独作用时会促进酸腐病的发生。与单株细菌相比合成群落处理对酸腐病的控制效果最佳。(3)细菌合成群落浸泡处理果实可显著降低柑橘果实采后自然发病率,其效果与咪酰胺处理相当,有较高的商业应用潜力。浸泡处理后的柑橘附生细菌群落结构能够较长时间保持相对稳定的群落结构。综上所述,研究了蜜桔果实附生微生物群的物种与功能关联,通过不同品种果实附生微生物群的扩增子测序分析,筛选核心

关键词：附生微生物群高通量测序合成群落柑橘生物防治