丹参根系培养放线菌组及其功能研究

作     者：吴玉瑞 

作者单位：成都中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：严铸云

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：丹参 根系培养放线菌 物种组成 功能分析 合成群落 

摘      要：丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎,是临床常用于预防和治疗心血管疾病的重要药物。研究表明,内生菌能发挥调控丹参药材产量和质量的作用;放线菌是一类能赋予宿主植物有益性状的微生物,但丹参根系放线菌组的组成及其功能尚缺乏系统的研究。本研究以四川中江道地产区丹参为研究材料,采用不同培养基分离、纯化并保存丹参根系放线菌。利用测序技术进行分子鉴定和宏基因组功能分析,并进行体外益生功能筛选。综合考虑菌株亲缘关系和功能特性构建5个合成放线菌群落,在1/2 N、1/2 P和1/2 Fe的Hoagland营养条件下考察这些群落对丹参生长发育、氮磷铁代谢、抗性和活性成分的影响。以解析丹参根系培养放线菌组的组成及其功能。本研究取得了以下结果:(1)丹参根系培养放线菌的种类和功能丰富多样。采用不同培养基从丹参根和根际土中共分离、纯化和保存了369株根系放线菌,经16S r RNA测序和序列比对归并为3科,4属,46种,72株;其中根内特有放线菌15种,根际特有14种,二者共有17种,均以链霉菌属为优势属。利用宏基因组测序技术从这些放线菌中获得了428014个非冗余基因,通过KEGG数据库注释了86.57%的基因,它们大多数与碳水化合物代谢途径相关;通过egg NOG数据库注释了77.36%的基因,主要参与转录以及碳水化合物的运输和代谢;通过CAZy数据库注释了5.87%的基因,主要是糖苷水解酶的类型。此外,注释到了链霉素、新霉素等抗生素合成相关的基因,以及植物激素、氮代谢、磷代谢、铁载体合成、抗病虫害等促生相关基因/酶。益生功能活性(PGP)测定表明,52株放线菌能在无氮培养基上生长,25株菌能产生铁载体,24株能溶解无机磷;37株可产生植物生长素,尤以菌株SA047的产量最高;其中有7株菌具有上述各项PGP功能。可见,丹参根系培养放线菌组的物种组成和功能丰富多样,为利用根系放线菌组改善丹参药材品质奠定了重要的数据和基础材料。(2)放线菌群落能调控丹参的生长发育。依据PGP菌株的亲缘关系和功能特性构建了5个合成放线菌群落,考察这些群落在1/2 N、1/2 P和1/2 Fe的Hoagland营养条件下对丹参生长发育的影响。结果表明5个合成放线菌群落均有促进丹参植株鲜重积累的趋势,其中有2个群落能显著提高丹参幼苗总鲜重,分别提高了30.3%和25.5%。丹参幼苗总鲜重与叶绿素含量、叶绿素荧光参数、氮代谢相关酶、酸性磷酸酶、高铁还原酶和抗氧化酶等指标的相关性分析表明,合成放线菌群落通过提高植物光合作用效率、养分吸收和利用效率以及提高植物抗性而促进植物生长。同时,依据PGP功能互补构建的群落较全功能菌株构建的群落益生作用更加明显。提示PGP功能互补是构建合成益生群落的良好策略。(3)放线菌群落能调节丹参次生代谢物的比例和含量。采用UPLC-MS/MS测定丹参根中8种活性成分的含量,考察接种合成放线菌群落对丹参次生代谢物的影响。结果表明,3个群落提高总酚酸类含量分别达31%、11%和6%,降低总酮类的含量分别达34%、37%和18%;1个群落提高总酚酸类和总酮类成分含量分别是18%和13%,1个群落降低总酚酸类和总酮类含量分别达3%和26%。丹参次生代谢物与合成群落结构关系的进一步分析表明,菌株之间的亲缘关系影响活性成分含量的效应较菌株功能更明显,菌株亲缘关系远的群落主导提高丹参总酚酸类成分含量的效应,亲缘关系近的群落主导调控丹参总酮类成分的效应。提示放线菌群落能够发挥调控丹参次生代谢物合成的作用。综上可见,本研究工作构建了丹参根系培养放线菌组菌株库,明确了丹参根系培养放线菌组的功能。通过合成PGP功能群落与丹参试管苗共培养,发现益生群落通过提高光合效率、抗性和矿质元素吸收和利用效率,而发挥调节植物生长发育的作用;进一步证实植物放线菌组能发挥调控药用植物药材产量、质量和减少肥料施用等有益作用。同时,本研究结果表明功能互补是构建人工合成益生群落的良好策略,也获得了能减少肥料施用并提高丹参产量和质量的最优群落。本研究构建了定向调控丹参药材品质的重要生物资源,为丹参药材生产定向调控提供了新思路和技术,也为理解植物微生物互作机理奠定了坚实的基础。