检索结果-南通市图书馆

高粱5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)叶绿体转运肽(CTP)的克隆及其在转基因玉米中的功能验证

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

农业生物技术学报 2013年第9期21卷 1009-1018页

作者：赵海铭宋伟彬赖锦盛中国农业大学农业生物技术国家重点实验室及国家玉米改良中心

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)催化莽草酸-3-磷酸(S3P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP),具有与草甘膦结合的活性位点,且结合后会抑制EPSPS的活性,在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值... 详细信息

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)催化莽草酸-3-磷酸(S3P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP),具有与草甘膦结合的活性位点,且结合后会抑制EPSPS的活性,在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值。为了培育抗草甘膦玉米(Zea mays),本研究通过对高粱(Sorghum bicolor)EPSPS基因的结构分析,克隆了该基因5’端的叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide,CTP)。将该转运肽与来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4 EPSPS基因整合,以Ubiquitin为启动子,35S polyA为终止子,构建表达载体,同时以不含有转运肽的CP4 EPSPS基因为对照,遗传转化玉米得到稳定转基因株系;用PCR、Southern blot、ELISA等方法检测转基因玉米CP4 EPSPS基因的表达量并对其进行草甘膦抗性检测,研究发现,不含转运肽的转化事件虽然CP4 EPSPS基因表达量与含有转运肽的基本一致但却不具有草甘膦抗性,而含有转运肽的转化事件则抗性明显。说明转运肽并不影响CP4 EPSPS基因的表达,但对转基因植株草甘膦抗性起着重要作用,说明本研究克隆的叶绿体转运肽能够正常行使其生物学功能。研究结果为利用EPSPS基因培育抗草甘膦作物提供了重要参考资料。

关键词：叶绿体转运肽高粱 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶转基因玉米

水稻Rubisco激酶基因叶绿体转运肽增强转基因表达

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

福建农业学报 2013年第2期28卷 95-100页

作者：李想林智敏陈在杰王成虎刘霞王锋福建师范大学生命科学学院福建福州350000 福建省农业科学院生物技术研究所福建福州350003

将水稻RCA基因N端预测的转运肽(TP)序列融合报告基因GFP,构建瞬时表达载体pGD-RCATP-GFP,转化农杆菌后,注射侵染烟草叶片,通过荧光显微镜观察瞬时表达情况,结果表明外源蛋白GFP定位在叶绿体上,依此预测水稻RCA基因N端48aa为叶绿体转运... 详细信息

将水稻RCA基因N端预测的转运肽(TP)序列融合报告基因GFP,构建瞬时表达载体pGD-RCATP-GFP,转化农杆菌后,注射侵染烟草叶片,通过荧光显微镜观察瞬时表达情况,结果表明外源蛋白GFP定位在叶绿体上,依此预测水稻RCA基因N端48aa为叶绿体转运肽。将该序列与报告基因GUS融合,构建植物表达载体p1300-RCATP-AGS,转化水稻后,检测阳性株叶片的GUS酶活,其GUS蛋白表达效率是未连有叶绿体转运肽的转基因植物的4.2倍左右。

关键词： RCA(二磷酸核酮糖羧化酶激酶) 叶绿体转运肽 GUS酶活分析

维普期刊数据库

转1174AALdico-2+CTP耐草甘膦优异棉花种质系的创制及其特性

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国农业科学 2023年第17期56卷 3261-3276页

作者：王宛如曹跃芬盛况陈进红赵天伦祝水金浙江大学农业与生物技术学院浙江大学海南研究院

【目的】棉田杂草是限制棉花生长的因素之一，与棉花争夺营养、水分和光照，不仅影响棉花的生长发育，还影响棉花的产量和品质。通过基因工程途径培育高耐草甘膦优异棉花种质，实现棉田间化学除草，提高植棉的经济效益。【方法】将来源... 详细信息

【目的】棉田杂草是限制棉花生长的因素之一，与棉花争夺营养、水分和光照，不仅影响棉花的生长发育，还影响棉花的产量和品质。通过基因工程途径培育高耐草甘膦优异棉花种质，实现棉田间化学除草，提高植棉的经济效益。【方法】将来源于耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）的EPSPS基因1174AALdico-2连接叶绿体转运肽，以35S为启动子，将2个目的基因串联后构建棉花转化载体。运用农杆菌活体转化技术，将目的基因导入棉花品种中棉所49，获得阳性转化体植株。以受体材料中棉所49和转化体自交分离得到的非转基因NON为对照，对转化体植株进行分子特征检测、草甘膦耐受性鉴定、农艺性状和经济性状等综合评价，以筛选出优良的转基因耐草甘膦棉花材料。【结果】通过农杆菌活体转化方法获得138个阳性转化体，对转化体植株进行目的基因PCR检测、Southern blot、Western blot分析和ELISA检测，从中筛选出17个分子特征明确、外源基因表达量高的阳性转化体。Southern blot和核苷酸测序结果表明，转化体插入位点和拷贝数各不相同，其中，ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体为单拷贝插入位点，外源基因插入位点分别位于棉花D亚组第7染色体、D亚组第13染色体和A亚组第12染色体。草甘膦耐受性鉴定结果表明，17个阳性转化体均高耐草甘膦，其中ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体的耐受性在3个世代之间稳定遗传，可耐4倍的田间草甘膦推荐剂量。农艺性状和经济性状评估结果表明，ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体植株生长发育正常，表现出铃大、衣分高、结铃性强等特点，皮棉产量超过对照，纤维品质达到优质棉水平。【结论】将来源于耐辐射奇球菌的EPSPS基因1174AALdico-2与叶绿体转运肽连接，多基因串联后构建转化载体，农杆菌活体转化技术转入中棉所49，通过一系列筛选后获得3份优良的转基因耐草甘膦材料ZD131、ZD185和ZD207，该方法在提高棉花耐草甘膦水平的同时，也提高了转基因材料的农艺和经济性状。

关键词：棉花 EPSPS 叶绿体转运肽草甘膦皮棉产量纤维品质

草甘膦抗性和磷高效吸收复合基因转化玉米的研究

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

甘肃农业大学学报 2019年第1期54卷 42-50页

作者：曹智张晶晶张志恒王威石菁王朋宝张金文甘肃省干旱生境作物学重点实验室甘肃农业大学农学院甘肃兰州730070 甘肃农业大学资源与环境学院甘肃兰州730070 甘肃天亿兴种业有限责任公司甘肃金昌737205

【目的】草甘膦是世界上用途最广的除草剂之一,磷是玉米生长发育所必需的大量营养元素,培育抗草甘膦兼具高效磷素吸收利用的复合性状对玉米生产有重要意义.【方法】构建由Ubiquitin1启动子驱动的两种叶绿体转运肽/CP4 EPSPs融合基因,和... 详细信息

【目的】草甘膦是世界上用途最广的除草剂之一,磷是玉米生长发育所必需的大量营养元素,培育抗草甘膦兼具高效磷素吸收利用的复合性状对玉米生产有重要意义.【方法】构建由Ubiquitin1启动子驱动的两种叶绿体转运肽/CP4 EPSPs融合基因,和根特异性启动子GLU1P驱动的植酸酶基因phyA2双价植物表达载体,通过农杆菌介导法对玉米茎尖进行转化.对转基因植株进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析、不同浓度草甘膦检测以及丙酮-磷钼酸铵法测定.【结果】获得9株阳性转基因植株;发现不同转运肽对EPSPs基因的表达量影响不同,且对草甘膦的抗性也不同;转基因植株植酸酶活性比野生型植株平均提高18.7倍.【结论】本研究为获得具有草甘膦抗性和磷素高效吸收利用复合性状的转基因玉米优良种质奠定了基础.

关键词：玉米叶绿体转运肽 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶植酸酶遗传转化

维普期刊数据库

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

莱茵衣藻叶绿体转化株构建及评价方法探索

莱茵衣藻叶绿体转化株构建及评价方法探索

作者：曹慧佼大连工业大学

学位级别：硕士

微藻作为一类重要的光合生物,在生物能源和天然产物开发领域具有潜在的优势,尤其是真核微藻细胞内具有单一叶绿体,是优良的叶绿体细胞器工厂的宿主。然而,由于相应基因操作工具和候选筛选评价手段的缺乏,限制了通过现代生物工程以及合... 详细信息

微藻作为一类重要的光合生物,在生物能源和天然产物开发领域具有潜在的优势,尤其是真核微藻细胞内具有单一叶绿体,是优良的叶绿体细胞器工厂的宿主。然而,由于相应基因操作工具和候选筛选评价手段的缺乏,限制了通过现代生物工程以及合成生物学技术对微藻进行改造技术的发展。为此,本论文以实验室前期建立的核转化叶绿体表达模式为基础,进一步探索莱茵衣藻叶绿体细胞器工厂构建技术,包括:以前期构建的高固碳转化株为对象,考察利用Algal Station平台进行转化株的反应器培养评价可行性;以中链脂肪酸硫酯酶为对象,打通从构建到突变株培养评价的流程。主要内容如下:(1)以Algal Station平台为基础,以叶绿素荧光动力学参数F/F为主要指标,以过表达叶绿体型三磷酸甘油醛脱氢酶(chloroplastic Glycer Aldehyde-3-Phosphate De Hydrogenase,c GAPDH)的P3-GAPDH为对象,进行反应器培养评价,获得了稳定重现的培养效果,在1.5 L平板式光生物反应器中,生物量达到了1.74 g L,生物量产率达到了28.54 mg L h,为已报道相近培养条件下最高水平;结合精细的F/F连续监测以及脂肪酸成分分析,推测该转化株的高生物量积累能力得益于c GAPDH对光合暗反应固碳代谢产物向下游代谢的拉动作用,为进一步开发高效CO利用藻株提供了生物学和藻种基础,同时也证明了Algal Station平台用于突变藻株评价的可行性和优势。(2)以萼距花中链脂肪酸硫酯酶(Ch Fatb2)为对象,分别构建融合高表达基因,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(Ru Bis CO)小亚基和中等水平表达基因,磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)叶绿体转运肽的表达系统,进行电击转化。经过抗生素抗性筛选和PCR插入验证,最终分别获得3株阳性克隆和8株阳性克隆,转化率分别达到了20.0%和34.8%,随后对这些藻株进行生理生化方面的评价。(3)以TAP培养基培养为基础,对突变株进行评价,发现转化株在生长、叶绿素荧光、脂肪酸含量均与野生株有差异,但是未检测到明显的中链脂肪酸,初步表明转运肽的差异对插入蛋白的表达效果具有潜在影响。进一步使用癸烷添加培养、缺氮培养,仍没有获得明显的中链脂肪酸含量变化,同时通过Ch Fatb2携带的Histag进行Western blot鉴定,未能发现蛋白条带。最终通过本论文的研究,尽管未能获得中链脂肪酸高水平积累突变株,但是打通了从载体构建、转化、初筛到1.5 L反应器规模评价的流程,并为后续进一步验证不同转运肽融合对转录、蛋白折叠、定位提供了实验和生物材料基础。

关键词：莱茵衣藻核转化叶绿体工程叶绿体转运肽工程藻株筛选评价

不同调控元件对外源epsps基因在水稻中功能的影响

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

不同调控元件对外源epsps基因在水稻中功能的影响

作者：田水秀福建农林大学

学位级别：硕士

水稻（Oryza sativa L）是最重要的粮食作物之一。在水稻的生产种植过程中，杂草危害可造成水稻大幅减产。草甘膦是一种应用广泛的、高效广谱的非选择性除草剂，但它在农田直接使用会对作物产生伤害，甚至致其死亡。因此，培育抗草甘膦... 详细信息

水稻（Oryza sativa L）是最重要的粮食作物之一。在水稻的生产种植过程中，杂草危害可造成水稻大幅减产。草甘膦是一种应用广泛的、高效广谱的非选择性除草剂，但它在农田直接使用会对作物产生伤害，甚至致其死亡。因此，培育抗草甘膦水稻对提高水稻产量、改革耕作制度、提高劳动生产率具有重要意义。本研究分别应用Ubiquitin和CaMV35S两种启动子来驱动，以不同转运肽、kozak序列、omega序列与cp4epsps基因、水稻内源epsps突变基因相融合，分析不同调控元件对外源epsps基因在水稻中表达的影响，旨在培育高抗草甘膦转基因水稻。研究结果如下： 1、将转运肽、kozak序列、omega序列等调控元件分别与cp4epsps基因和Osepspsm基因融合构建了7个植物表达载体，通过农杆菌转化介导法转化水稻，共获得261个阳性克隆;2、将来源于矮牵牛花和水稻的转运肽序列分别与gfp基因融合构建瞬时表达载体，利用注射法将其导入烟草叶片中，显微镜荧光观察结果表明矮牵牛花EPSPS前导肽CTP4和水稻内源EPSPS转运肽OsCTP都将GFP定位于叶绿体中，说明CTP4和OsCTP两条转运肽都具有叶绿体细胞定位功能;3、通过RT-PCR半定量方法检测epsps基因的转录，结合喷施草甘膦前后的莽草酸含量变化以及对各克隆转基因水稻喷施不同浓度10%草甘膦药液的田间检测进行分析，结果表明：cp4epsps和Osepspsm基因均可赋予转基因水稻高于10%草甘膦商业建议用量五倍以上浓度的耐受性;OsCTP比CTP4对OsEPSPSM具有更好的转运效率;Ubiquitin启动子和CaMV35S启动子对EPSPS蛋白表达无明显影响;omega序列会降低EPSPS蛋白对草甘膦的抗性。

关键词：抗草甘膦转基因水稻 epsps基因叶绿体转运肽调控序列

拟南芥ats1A基因启动子的克隆和功能分析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

西北植物学报 2004年第10期24卷 1856-1860页

作者：王利军范三红郭蔼光西北农林科技大学生命科学学院陕西杨陵712100 陕西省农业分子生物学重点实验室陕西杨陵712100

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出ats1A基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,ats1A基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。

关键词：拟南芥 atslA基因启动子叶绿体转运肽烟草微弹轰击

维普期刊数据库

拟南芥atslA基因启动子和ats2B基因启动子的克隆及其功能分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

拟南芥atslA基因启动子和ats2B基因启动子的克隆及其功能分析

作者：王利军西北农林科技大学

学位级别：硕士

近年来利用植物作为生物反应器生产目的产品成就瞩目,正成为基因工程研究中新的热点。借助于高活性特异表达的启动子提高外源基因的表达量,以及使外源基因只在特定的发育阶段在特定的组织或器官中表达,成为植物生物反应器研究的关键... 详细信息

近年来利用植物作为生物反应器生产目的产品成就瞩目,正成为基因工程研究中新的热点。借助于高活性特异表达的启动子提高外源基因的表达量,以及使外源基因只在特定的发育阶段在特定的组织或器官中表达,成为植物生物反应器研究的关键技术之一。 Rubisco即核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(E.C.4.***.1.39.),是叶绿体中光合CO2 固定的关键酶也是叶绿体中含量最为丰富的蛋白,约占叶片可溶性蛋白的50%以上。 ats1A基因和ats2B基因是拟南芥中编码Rubisco小亚基的两个基因,这两个基因位于细胞核中,对它们的调控元件、启动子活性和组织特异性的研究,为外源基因在植物中的特异高效表达提供一种新的途径。另外,利用叶绿体转运信号肽将外源基因产物定位到叶绿体中可提高其积累水平,因而也是提高外源基因表达量的一种有效策略。本研究利用 PCR克隆了拟南芥ats1A基因启动子和ats2B基因启动子(均包含叶绿体的转运信号肽), 并对其序列进行了分析,然后将ats1A基因启动子(包含叶绿体的转运信号肽)构建植物瞬时表达载体p18T-Gus,通过瞬时表达对其活性进行了分析。通过以上研究工作,得到的主要研究结果如下: 1. PCR 方法克隆到了 ats1A 基因和 ats2B 基因的 5′端上游片段(包含启动子部分和叶绿体转运肽),并分别构建了克隆载体 p18T1a 和 p18T2b。 2. 用植物顺式作用元件数据库分别对 ats1A 基因启动子和 ats2B 基因的启动子区的 DNA 顺式作用元件进行了分析。 3.将 ats1A 基因启动子连接在 Gus 报告基因的上游,构建了瞬时表达载体 p18T1a-gus。 4.通过基因枪法将瞬时表达载体p18T1a-gus分别导入到烟草的叶片,茎段,根段进行瞬时表达,Gus的组化染色分析表明,ats1A基因启动子能够启动外源基因在烟草叶片中高效表达,ats1A基因启动子是进行植物生物反应器研究的一个良好的候选启动子。

关键词： ats1A基因启动子 ats2B基因启动子叶绿体转运肽微弹轰击拟南芥烟草

草甘膦抗性和磷高效吸收复合基因转化玉米的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

草甘膦抗性和磷高效吸收复合基因转化玉米的研究

作者：曹智甘肃农业大学

学位级别：硕士

提高土壤营养元素吸收利用和轻简化栽培是目前玉米生产中的迫切需求。草甘膦是世界上用途最广的除草剂之一,磷是玉米生长发育所必需的大量营养元素,培育抗草甘膦兼具高效磷素吸收利用的复合性状对玉米生产有重要意义。本研究构建由Ubiqu... 详细信息

提高土壤营养元素吸收利用和轻简化栽培是目前玉米生产中的迫切需求。草甘膦是世界上用途最广的除草剂之一,磷是玉米生长发育所必需的大量营养元素,培育抗草甘膦兼具高效磷素吸收利用的复合性状对玉米生产有重要意义。本研究构建由Ubiquitin1启动子驱动的不同叶绿体转运肽/CP4 EPSPs融合基因和根特异性启动子GLU1P驱动的植酸酶基因phyA2双价植物表达载体,通过农杆菌介导法对玉米茎尖进行转化。为获得具有草甘膦抗性和磷素高效吸收利用复合性状的转基因玉米优良种质奠定了基础。目前研究取得了主要结果如下:1.本研究利用TargetP1.1和ChloroP1.1预测发现全长170 aa的rbcS序列中含有叶绿体转运肽,切割位点可能位于第46个残基附近。在此基础上确定rbcS的N端74个aa的编码序列为候选片段,碱基长度共222 bp。2.采用PCR技术和重叠延伸PCR技术,得到CEPSP、MEPSP、Ubiquitin、GLU1P、phyA2和Nos基因,测序结果与GenBank数据库比对,同源性均达到98%以上,说明成功获得目的基因。3.以pCEPSP载体为原始载体,采用双酶切和In-Fusion同源重组方法构建植物表达载体pCE-NGC3和pCE-NGM3,并利用冻融转化法将所获得的植物表达载体导入农杆菌EHA105中。通过农杆菌介导法对玉米茎尖进行转化,共获得9株阳性转基因植株,其中‘TY7-2’4株(转CEPSP基因2株、转MEPSP基因2株)、‘TY4CV’5株(转CEPSP基因2株、转MEPSP基因3株)。4.对转基因玉米植株和野生型植株(CK)检测发现,转基因植株叶片中EPSPs基因的表达量明显提高,在转化的转基因植株中,玉米叶绿体转运肽(CC)与EPSPs融合的基因(CEPSP)要比融合Barry等报道的转运肽(CM)基因的表达量平均提高了31%,且表现出更好的抗性。5.对转基因植株的植酸酶酶活力测定结果表明,转化植株的植酸酶酶活力提高15～23倍。

关键词：叶绿体转运肽 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶遗传转化基因表达植酸酶玉米