莱茵衣藻叶绿体转化株构建及评价方法探索

作     者：曹慧佼 

作者单位：大连工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：田晶;曹旭鹏

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：莱茵衣藻 核转化 叶绿体工程 叶绿体转运肽 工程藻株筛选评价 

摘      要：微藻作为一类重要的光合生物,在生物能源和天然产物开发领域具有潜在的优势,尤其是真核微藻细胞内具有单一叶绿体,是优良的叶绿体细胞器工厂的宿主。然而,由于相应基因操作工具和候选筛选评价手段的缺乏,限制了通过现代生物工程以及合成生物学技术对微藻进行改造技术的发展。为此,本论文以实验室前期建立的核转化叶绿体表达模式为基础,进一步探索莱茵衣藻叶绿体细胞器工厂构建技术,包括:以前期构建的高固碳转化株为对象,考察利用Algal Station平台进行转化株的反应器培养评价可行性;以中链脂肪酸硫酯酶为对象,打通从构建到突变株培养评价的流程。主要内容如下:(1)以Algal Station平台为基础,以叶绿素荧光动力学参数F/F为主要指标,以过表达叶绿体型三磷酸甘油醛脱氢酶(chloroplastic Glycer Aldehyde-3-Phosphate De Hydrogenase,c GAPDH)的P3-GAPDH为对象,进行反应器培养评价,获得了稳定重现的培养效果,在1.5 L平板式光生物反应器中,生物量达到了1.74 g L,生物量产率达到了28.54 mg L h,为已报道相近培养条件下最高水平;结合精细的F/F连续监测以及脂肪酸成分分析,推测该转化株的高生物量积累能力得益于c GAPDH对光合暗反应固碳代谢产物向下游代谢的拉动作用,为进一步开发高效CO利用藻株提供了生物学和藻种基础,同时也证明了Algal Station平台用于突变藻株评价的可行性和优势。(2)以萼距花中链脂肪酸硫酯酶(Ch Fatb2)为对象,分别构建融合高表达基因,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(Ru Bis CO)小亚基和中等水平表达基因,磷脂二酰甘油酰基转移酶(PDAT)叶绿体转运肽的表达系统,进行电击转化。经过抗生素抗性筛选和PCR插入验证,最终分别获得3株阳性克隆和8株阳性克隆,转化率分别达到了20.0%和34.8%,随后对这些藻株进行生理生化方面的评价。(3)以TAP培养基培养为基础,对突变株进行评价,发现转化株在生长、叶绿素荧光、脂肪酸含量均与野生株有差异,但是未检测到明显的中链脂肪酸,初步表明转运肽的差异对插入蛋白的表达效果具有潜在影响。进一步使用癸烷添加培养、缺氮培养,仍没有获得明显的中链脂肪酸含量变化,同时通过Ch Fatb2携带的Histag进行Western blot鉴定,未能发现蛋白条带。最终通过本论文的研究,尽管未能获得中链脂肪酸高水平积累突变株,但是打通了从载体构建、转化、初筛到1.5 L反应器规模评价的流程,并为后续进一步验证不同转运肽融合对转录、蛋白折叠、定位提供了实验和生物材料基础。