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莱茵衣藻CrHPR4基因的过表达及其功能分析

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分子植物育种 2024年

作者：崔梅杰闫睢豪王庆侯余勇郭之乐马彦波邓必成路思晗吕和鑫赵磊天津科技大学生物工程学院中国科学院天津工业生物技术研究所中国科学院天津工业生物技术研究所低碳合成工程生物学重点实验室

在莱茵衣藻羟基丙酮酸还原酶家族5个成员中，CrHPR4是唯一定位于叶绿体的蛋白，探究CrHPR4的生物学功能对认识微藻碳代谢过程有重要意义。本研究以莱茵衣藻为研究对象，构建了CrHPR4基因表达质粒pHK263-CrHPR4。采用玻璃珠法转化莱茵衣... 详细信息

在莱茵衣藻羟基丙酮酸还原酶家族5个成员中，CrHPR4是唯一定位于叶绿体的蛋白，探究CrHPR4的生物学功能对认识微藻碳代谢过程有重要意义。本研究以莱茵衣藻为研究对象，构建了CrHPR4基因表达质粒pHK263-CrHPR4。采用玻璃珠法转化莱茵衣藻UVM4，基于巴龙霉素平板筛选、液体培养、藻落PCR和Western Blot验证等，获得CrHPR4过表达藻株OE-1和OE-2。表型分析结果表明：相较于野生株，过表达藻株在自养培养基条件下，其细胞密度和PSⅡ最大光化学量子产量分别提高了29.3％和19.5％、9.3％和12.0％。这表明，过表达衣藻叶绿体型CrHPR4能提升光合作用效率，增加生物量。过表达藻株中NAD+/NADH分别提升166.5％和251.5％，这表明CrHPR4参与以NADH为辅因子的叶绿体生物反应过程。该研究为深入解析CrHPR4基本功能，探究其参与光合固碳的具体作用机制提供了重要科学依据。

关键词：莱茵衣藻羟基丙酮酸还原酶碳代谢光合作用合成生物学

莱茵衣藻蛋白的提取及单胺氧化酶A抑制肽的筛选

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食品工业科技 2024年

作者：刘玫婷毛丫谢劲涛刘文侠吴立夏吴移山王媚张学武华南理工大学食品科学与工程学院湛江市质量计量监督检测所

本文旨在研究莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的蛋白提取方法并筛选抑制单胺氧化酶A（MAO-A）的肽段，以莱茵衣藻为原料，采用溶胀、超声、碱溶酸沉及盐析法提取分离纯化蛋白，对提取的蛋白进行酶解及超滤，测定其多肽含量、氨... 详细信息

本文旨在研究莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的蛋白提取方法并筛选抑制单胺氧化酶A（MAO-A）的肽段，以莱茵衣藻为原料，采用溶胀、超声、碱溶酸沉及盐析法提取分离纯化蛋白，对提取的蛋白进行酶解及超滤，测定其多肽含量、氨基酸组成、分子量分布及MAO-A活性抑制率等，并借助生物信息学手段，将活性肽段与MAO-A进行对接，分析其结合位点。结果表明：通过溶胀4 h，240 W超声4次（10 min/次），碱溶（pH 9.5）酸沉（pH 3.5），饱和硫酸铵添加比例1:2后，蛋白提取率达50.98%±2.50%。经酶解后的碱性蛋白酶解物（APH）和中性蛋白酶解物（NPH）对MAO-A有显著的抑制作用（p＜0.05），IC50值分别为3.437、2.699 mg/mL。经超滤后，APH和NPH中分子量＜3kDa的超滤组分（APH-III和NPH-III）对MAO-A活性抑制率与酶解物相比显著较高（p＜0.05），IC50值分别为3.116、0.909 mg/mL。从APH-III和NPH-III中鉴定的多肽与MAO-A对接后发现，NPH-III中ASDDAVHGWGGPGGY与AYSGETQSEGGFAPNR两条多肽能与MAO-A的活性位点His488、Glu286、Tyr53、Tyr268、Asp343、Glu485结合。

关键词：莱茵衣藻蛋白提取 MAO-A抑制肽分子对接

高碳低氮条件下培养基中磷水平对莱茵衣藻生长及油脂合成的影响

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中国油脂 2024年第9期49卷 101-108页

作者：冯天孙守瑞宋佳美华兰郑世燕王强江苏海洋大学、江苏省海洋生物资源与环境重点实验室江苏省海洋生物技术重点实验室江苏连云港222005 江苏海洋大学、江苏省海洋生物产业技术协同创新中心江苏连云港222005 河南大学作物逆境适应与改良国家重点实验室河南开封475004

为进一步提高莱茵衣藻的生物量和油脂含量,在前期已明确最佳碳氮水平的基础上,通过分析不同磷水平下莱茵衣藻生物量、油脂含量、叶绿素a和叶绿素b含量、油脂脂肪酸组成及含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量等指标的变化,探究高碳低氮... 详细信息

为进一步提高莱茵衣藻的生物量和油脂含量,在前期已明确最佳碳氮水平的基础上,通过分析不同磷水平下莱茵衣藻生物量、油脂含量、叶绿素a和叶绿素b含量、油脂脂肪酸组成及含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量等指标的变化,探究高碳低氮条件下培养基中磷水平(0P、1/8P、1/4P、2/4P、4/4P、5/4P)对该藻生长及油脂积累的影响。结果表明:随着培养基中磷水平的增加,莱茵衣藻生物量、油脂含量和油脂产率呈先增加后降低的趋势,培养5 d,磷水平1/8P时的生物量、油脂含量和油脂产率最高,分别为2.27 g/L、43.35%和191.31 mg/(L·d),分别比0P时提高91.55%、13.09%和1.23倍;培养5 d,磷水平5/4P时叶绿素a和叶绿素b含量最高,分别达到5.15 mg/L和3.46 mg/L,分别比0P时高2.30倍和0.65倍;当磷水平为1/8P~5/4P时,莱茵衣藻油中各脂肪酸含量总体差异不显著,但其多不饱和脂肪酸含量均显著低于0P时的,饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量则显著高于0P时的;随培养基中磷水平的增加,可溶性糖含量呈上升趋势,而可溶性蛋白含量呈降低趋势。综上,在高碳低氮条件下,与常规磷水平培养基培养相比,适当降低培养基中磷水平可进一步提高莱茵衣藻的生物量和油脂含量,同时获得较高的可溶性糖和可溶性蛋白含量。

关键词：莱茵衣藻磷水平微藻生物量油脂脂肪酸组成

莱茵衣藻小G蛋白ARL1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

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天津科技大学学报 2024年

作者：陶冶鲍冬雪刘雁霞樊振川天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室天津科技大学大健康生物技术国家国际科技合作基地

为研究小G蛋白ARL1在纤毛生成和纤毛信号转导过程中的作用，特制得一支特异性较强的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）ARL1多克隆抗体。构建6×His标签的原核表达载体pET-28a(+)-arl1，并在大肠杆菌（E. coli）DH5α/C+感受态中诱... 详细信息

为研究小G蛋白ARL1在纤毛生成和纤毛信号转导过程中的作用，特制得一支特异性较强的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）ARL1多克隆抗体。构建6×His标签的原核表达载体pET-28a(+)-arl1，并在大肠杆菌（E. coli）DH5α/C+感受态中诱导表达融合蛋白6×His-ARL1，经纯化后免疫新西兰雄性大白兔。3次免疫后取耳动脉血清，以间接ELISA法测试效价后取血。通过Protein A和抗原抗体亲和纯化后获得了灵敏度高、特异性强的ARL1抗体。通过免疫荧光和免疫印迹（Western blot）检测，发现大量ARL1定位于细胞质、细胞基体和纤毛，为后续研究ARL1在莱茵衣藻纤毛生成和信号转导中的功能奠定了基础。

关键词： ARL1 原核表达多克隆抗体莱茵衣藻

二氧化硅纳米颗粒暴露对莱茵衣藻生长及细胞代谢的影响

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防化研究 2024年第4期3卷 67-76页

作者：陶美胡雨晴赖金龙罗学刚张宇西南科技大学环境与资源学院生物质材料教育部工程研究中心西南科技大学生命科学与工程学院

为评估二氧化硅纳米颗粒（Silica Nanoparticles, SiO2NPs）对淡水微藻的影响，本研究以莱茵衣藻为供试对象，分析了不同浓度SiO2NPs暴露对莱茵衣藻生长速率、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）、叶绿素和微藻代谢网络的影响。研... 详细信息

为评估二氧化硅纳米颗粒（Silica Nanoparticles, SiO2NPs）对淡水微藻的影响，本研究以莱茵衣藻为供试对象，分析了不同浓度SiO2NPs暴露对莱茵衣藻生长速率、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）、叶绿素和微藻代谢网络的影响。研究发现：当SiO2NPs为400～800 mg/L时，其可显著抑制莱茵衣藻的增殖；200～800 mg/L的SiO2NPs暴露后，莱茵衣藻叶绿素a和叶绿素b的浓度分别较对照组下降27.89%～42.16%和16.28%～26.3%，且藻细胞内产生的ROS较对照组上升9.25%～24.9%;100 mg/L和800 mg/L的SiO2NPs显著改变了莱茵衣藻的代谢网络，包括脂质和类脂质分子、有机杂环化合物、有机酸及其衍生物等。通过代谢物分类注释基础代谢网络后分析发现，SiO2NPs影响了莱茵衣藻甘油磷脂类和有机杂环化合物代谢，特别是吲哚、吡啶、咖啡因等，并导致莱茵衣藻碳水化合物代谢、核苷酸合成、脂类和氨基酸代谢等基础代谢过程异常。本研究可为探索SiO2NPs对微藻的生物效应提供一定的理论基础和数据支持。

关键词：二氧化硅纳米颗粒莱茵衣藻代谢组学生长曲线活性氧

CrLEC1基因调控莱茵衣藻油脂合成的功能解析

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生物技术 2024年第3期34卷 295-303页

作者：张浩东李亚军谭德冠张家明马帅中国热带农业科学院热带生物技术研究所中国热带农业科学院海南热带农业资源研究海南海口571101 海南省热带微生物资源重点实验室海南海口571101

[目的]通过解析转录因子LEC1(Leafy cotyledon 1)在微藻油脂生物合成中的调控功能,为建立利用基因工程培育高含油量和高生物量微藻的育种策略提供基础。[方法]采用无缝克隆法构建含CrLEC1基因的过表达载体;采用玻璃珠转化法进行莱茵衣藻... 详细信息

[目的]通过解析转录因子LEC1(Leafy cotyledon 1)在微藻油脂生物合成中的调控功能,为建立利用基因工程培育高含油量和高生物量微藻的育种策略提供基础。[方法]采用无缝克隆法构建含CrLEC1基因的过表达载体;采用玻璃珠转化法进行莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC849转化;采用尼罗红荧光法测定转基因藻株的油脂含量。[结果]成功构建了pCam1304::LEC1::GFP载体,获得137个阳性转化的藻株,经检测有16个为转基因藻株。发现转基因藻株6-15的生长不受氮胁迫的影响,且在缺氮或含氮培养条件下其生长状况均较野生型藻株好;在缺氮培养条件下,转基因藻株6-15、6-9、5-22、5-25、5-34的油脂含量均显著高于野生型藻株。[结论]CrLEC1基因正调控莱茵衣藻的油脂合成。

关键词：莱茵衣藻转化过量表达转录因子 LEC1 油脂合成氮胁迫

莱茵衣藻腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的相互作用蛋白组分析

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北京理工大学学报 2015年第9期35卷 985-990页

作者：纪超凡曹旭鹏薛松修志龙大连理工大学生命科学与技术学院辽宁大连116024 大连化学物理研究所生物技术部辽宁大连116023

微藻利用光能和CO2合成淀粉作为藻细胞的储能物质,是以燃料乙醇为代表的液体生物燃料的可持续原料来源.理解微藻淀粉代谢关键酶的催化机制和调控方式是基因工程操作以提高藻细胞淀粉积累能力的前提.基于此,以莱茵衣藻淀粉合成代谢中的... 详细信息

微藻利用光能和CO2合成淀粉作为藻细胞的储能物质,是以燃料乙醇为代表的液体生物燃料的可持续原料来源.理解微藻淀粉代谢关键酶的催化机制和调控方式是基因工程操作以提高藻细胞淀粉积累能力的前提.基于此,以莱茵衣藻淀粉合成代谢中的关键酶腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化亚基为探针蛋白,获取该酶的GST融合蛋白后使用GST沉降分析实验结合HPLC-MS/MS的蛋白质检测技术及生物信息学分析方法获得一组与AGPase催化亚基存在相互作用蛋白质,主要包含分子伴侣蛋白、光合作用相关蛋白和信号蛋白分子等.通过综合分析上述蛋白组的生理功能及亚细胞定位,揭示了它们通过与AGPase相互作用在淀粉合成代谢中的生物学意义.

关键词：莱茵衣藻淀粉腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶蛋白质-蛋白质相互作用

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莱茵衣藻和根瘤菌共培养提高产氢条件的优化

太阳能学报 2015年第10期36卷 2565-2570页

作者：许丽丽徐潇吴双秀王全喜李德志华东师范大学资源与环境科学学院环境科学系上海200241 中国科学院北京基因组研究所基因组科学与信息重点实验室北京100101 上海师范大学生命与环境科学学院生物系上海200234

将莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)以不同比例与日本慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)混合,在不同光照条件下进行产氢培养,以确定产氢的最优条件和探索产氢提高的机理。结果表明:藻菌共培养的最优产氢条件为25℃、光照200... 详细信息

将莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)以不同比例与日本慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)混合,在不同光照条件下进行产氢培养,以确定产氢的最优条件和探索产氢提高的机理。结果表明:藻菌共培养的最优产氢条件为25℃、光照200μE/(m^2·s)、生长至饱和期的菌和藻体积比为1∶80,产氢量最大,约为272μmol/(mg Chl),是对照组的17.0倍。藻菌共培养提高产氢量的主要原因是体系中O_2浓度的降低使氢化酶活性提高以及衣藻生物量的增加。

关键词：莱茵衣藻根瘤菌共培养产氢培养优化生物量

莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白IFT81调控鞭毛组装

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工程科学学报 2015年第8期37卷 1105-1109页

作者：孙娟清华大学生命科学学院北京100084

利用插入突变的方式获得了一株衣藻不运动突变体ift81,该突变体表现出鞭毛缺失或者短鞭毛的性状.基因序列分析表明,外源基因aphⅧ插入了突变体中IFT81(intraflagellar transport,IFT)基因的第五个外显子内,并导致该外显子原有的52个碱... 详细信息

利用插入突变的方式获得了一株衣藻不运动突变体ift81,该突变体表现出鞭毛缺失或者短鞭毛的性状.基因序列分析表明,外源基因aphⅧ插入了突变体中IFT81(intraflagellar transport,IFT)基因的第五个外显子内,并导致该外显子原有的52个碱基对被替换.把含有完整IFT81基因的重组质粒导入突变体ift81后,其鞭毛恢复为野生型且可以检测到IFT81-HA融合蛋白的表达,这证明突变体的鞭毛缺陷确实是由于IFT81基因突变所导致.电镜观察显示突变体中鞭毛的显微结构发生改变,免疫荧光实验证实IFT81蛋白主要定位于基体和鞭毛部位.上述结果表明:IFT81蛋白缺失会导致衣藻鞭毛组装缺陷,在鞭毛组装所需蛋白的运输过程中,IFT81蛋白是必不可少的.

关键词：莱茵衣藻鞭毛组装蛋白