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新型抗菌肽C16-IG-13-1对变异链球菌抑制作用的研究

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新型抗菌肽C16-IG-13-1对变异链球菌抑制作用的研究

作者：袁文锦吉林大学

学位级别：硕士

目的:龋病作为口腔中最常见的慢性感染性疾病,具有发病率高、分布广泛的特点。变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)作为最主要的龋病致病菌,其致病性不仅包括产酸性和耐酸性,更为重要的是变异链球菌能够通过合成胞外多糖(Extrace... 详细信息

目的:龋病作为口腔中最常见的慢性感染性疾病,具有发病率高、分布广泛的特点。变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)作为最主要的龋病致病菌,其致病性不仅包括产酸性和耐酸性,更为重要的是变异链球菌能够通过合成胞外多糖(Extracellular polysaccharide,EPS)促进菌斑生物膜的形成。菌斑生物膜作为龋病的始动因子能够促进微生物相互作用、维持微环境的酸性理化特征。因此,使用抗生素抑制变异链球菌的活性并减少菌斑生物膜的形成是龋病防治的主要策略之一,但过度使用抗生素会导致细菌耐药性增强进而导致这一防治手段在长期治疗中效果不理想。抗菌肽(Antibacterial peptides,AMPs)作为天然抗菌剂主要通过破坏细胞膜发挥抗菌作用,这种特殊的抗菌机制使细菌不易产生耐药性。由于在耐药性方面弥补了抗生素的短板,并且具备良好的抑菌效果,使用AMPs进行龋病防治为临床治疗提供了新思路。特异性靶向抗菌肽(Specifically targeted antimicrobial peptides,STAMPs)不仅不易导致细菌产生耐药性,而且具有良好的靶向性,能够在不影响口腔正常菌群的情况发挥对致病菌的抑制作用。本文旨在设计并合成一种新型的针对变异链球菌的特异性靶向抗菌肽,为临床龋病的防治提供新方案。方法:1.通过查阅文献进行特异性靶向抗菌肽的设计,以CSPC16作为靶向定位区域,以抗菌肽IG-13-1作为抗菌区域,设计出新型特异性靶向抗菌肽C16-IG-13-1,利用PSIPRED蛋白质结构预测服务器对C16-IG-13-1的二级结构进行预测,并使用标准固相合成技术(Fmoc保护法)合成C16-IG-13-1。2.以C16-IG-13-1作为实验组,IG-13-1作为阳性对照组,CSPC16作为阴性对照组,采用微量肉汤稀释法检测上述三组多肽对S.mutans、血链球菌(Streptococcus sanguinis,S.sanguinis)以及黏性放线菌(Actinomyces viscosus,A.viscosus)的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)。3.通过平板菌落计数法计算C16-IG-13-1在1 min时对S.mutans、S.sanguinis以及A.viscosus的抗菌率。4.分别在加入C16-IG-13-1后的1 min、5 min、10 min、20 min、30 min、60min通过平板菌落计数法记录S.mutans、S.sanguinis以及A.viscosus的菌落数,并绘制时间-杀菌曲线。5.通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察空白对照组以及实验组(C16-IG-13-1组)中S.mutans的细胞形态变化。6.通过结晶紫染色法测定C16-IG-13-1对S.mutans生物膜形成的抑制作用,并通过MTT染色法观察在成熟S.mutans生物膜中C16-IG-13-1对S.mutans的抑制作用。结果:1.经PSIPRED蛋白质结构预测服务器预测C16-IG-13-1的二级结构主要为α-螺旋结构,并通过标准固相合成技术(Fmoc保护法)成功合成了C16-IG-13-1、IG-13-1及CSPC16。2.成功测定出C16-IG-13-1、IG-13-1和CSPC16对S.mutans,S.sanguinis和A.viscosus的MIC和MBC。其中C16-IG-13-1对S.mutans,S.sanguinis和A.viscosus的MIC分别为5μM、10μM和20μM,MBC分别为10μM、20μM和40μM。3.在1 min时,C16-IG-13-1对S.mutans的抗菌率为98.28%,对S.sanguinis的抗菌率为38.16%,对A.viscosus的抗菌率为8.62%,差异具有统计学意义(P<0.001)。4.通过时间-杀菌曲线可观察到浓度为10μM的C16-IG-13-1作用10 min时S.mutans全部死亡,S.sanguinis和A.viscosus在60 min时仍有大量细菌存活。5.SEM能够观察到空白对照组中S.mutans细胞完整,表面光滑,未见到细胞碎片或细胞裂解,而C16-IG-13-1组可观察到S.mutans细胞表面粗糙,细胞膜破裂,可见大量的细胞碎片。6.结晶紫染色结果显示C16-IG-13-1可明显减少S.mutans生物膜的形成,同时MTT实验结果证明C16-IG-13-1对成熟S.mutans生物膜有破坏作用。结论:1.本研究成功通过标准固相合成技术(Fmoc保护法)合成新型抗菌肽C16-IG-13-1。2.

关键词：龋病变异链球菌特异性靶向抗菌肽抗菌性能细菌生物膜

变异链球菌SMU.2055蛋白晶体结构及其小分子抑制剂设计与筛选

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华西口腔医学杂志 2015年第2期33卷 182-186页

作者：陈晓丹展秀荣吴昕彧赵春燕赵望泓南方医科大学南方医院口腔科南方医科大学口腔医学院广州510515 南开大学口腔医院天津市口腔医院牙体牙髓病科天津300041 兰州大学药学院兰州730000

目的研究变异链球菌UA159中SMU.2055蛋白的三维晶体结构,并基于其结构进行小分子抑制剂的设计与筛选。方法运用结构基因组学研究方法,通过基因克隆和表达、蛋白质纯化、晶体筛选、晶体衍射数据收集,解析SMU.2055蛋白三维晶体结构,并运... 详细信息

目的研究变异链球菌UA159中SMU.2055蛋白的三维晶体结构,并基于其结构进行小分子抑制剂的设计与筛选。方法运用结构基因组学研究方法,通过基因克隆和表达、蛋白质纯化、晶体筛选、晶体衍射数据收集,解析SMU.2055蛋白三维晶体结构,并运用计算机辅助药物设计方法,利用Libdock、Autodock两种程序,通过虚拟筛选和精确对接方式,建立与SMU.2055结构相匹配的小分子抑制剂虚拟模型。结果获得SMU.2055蛋白结晶,解析SMU.2055蛋白三维晶体结构,晶体衍射率为0.23 nm,属于C2221空间群,晶胞参数为a=9.20 nm,b=9.46 nm,c=19.39 nm,溶剂体积分数为56.7%。设计并筛选出与SMU.2055蛋白结构匹配度高的5个小分子化合物。结论变异链球菌SMU.2055蛋白质晶体学研究有助于从分子水平上深入了解变异链球菌蛋白质的结构和功能,筛选出的5个小分子化合物可能成为SMU.2055的有效小分子抑制剂,所建立的小分子抑制剂虚拟模型为基于蛋白质结构的防龋研究奠定基础。

关键词：变异链球菌蛋白质晶体学小分子抑制剂

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变异链球菌毒力相关转录调节因子的研究进展

华西口腔医学杂志 2016年第6期34卷 643-646页

作者：李蓝张博文李继遥口腔疾病研究国家重点实验室华西口腔医院牙体牙髓病科(四川大学) 成都610041 口腔疾病研究国家重点实验室华西口腔医院头颈肿瘤外科(四川大学) 成都610041

研究发现众多转录调节因子参与调节变异链球菌耐酸性等关键致龋毒力因子的表达,虽然仍有许多转录调节因子的作用靶点和调控机制尚不明确,但已有学者针对变异链球菌个别宏观转录调控因子进行单基因突变研究。本文就已发现的影响变异链球... 详细信息

研究发现众多转录调节因子参与调节变异链球菌耐酸性等关键致龋毒力因子的表达,虽然仍有许多转录调节因子的作用靶点和调控机制尚不明确,但已有学者针对变异链球菌个别宏观转录调控因子进行单基因突变研究。本文就已发现的影响变异链球菌致龋毒力因子表达的调节因子及其功能和可能的作用机制进行综述。

关键词：变异链球菌致龋毒力转录调节因子

掺铜的含氟生物活性玻璃对变异链球菌的抑制作用研究

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掺铜的含氟生物活性玻璃对变异链球菌的抑制作用研究

作者：邹松佑中南大学

学位级别：硕士

背景:龋病是一种主要由变异链球菌等细菌引起的多因素疾病,严重威胁着人们的口腔健康。含氟生物活性玻璃(FBG)可以在口腔唾液中降解,同时可控地释放出F、Ca和PO,具有生成耐酸氟磷灰石的优良再矿化效果和一定的抗菌性能。然而,高氟含量的... 详细信息

背景:龋病是一种主要由变异链球菌等细菌引起的多因素疾病,严重威胁着人们的口腔健康。含氟生物活性玻璃(FBG)可以在口腔唾液中降解,同时可控地释放出F、Ca和PO,具有生成耐酸氟磷灰石的优良再矿化效果和一定的抗菌性能。然而,高氟含量的FBG氟磷灰石的生成反而受到抑制,低氟含量FBG抗菌性能并不理想。因此,在具有良好再矿化作用的低氟玻璃中添加铜有望进一步提升其抗菌性能,达到更好的防龋效果。目的:设计和制备能生成耐酸氟磷灰石,且具有高效持久抑菌作用的一系列掺铜的低氟生物活性玻璃(FCu BG)。研究Cu对FBG的结构、体外生物活性和生物相容性的影响。揭示FCu BG对主要致龋菌变异链球菌(Streptococcus mutans)及其生物膜的抑菌效果及潜在机制。方法:通过高温熔融法制备了一系列不同铜含量(0-5 mol%)的FCu BG;用XRD、FTIR、DSC和MAS-NMR研究Cu对FBG结构的影响;利用FTIR、ICP-OES、ISE和CCK-8等方法评估玻璃的生物活性和生物相容性;结合Alamar Blue、稀释涂布平板法、SEM、活死菌染色、TEM和RT-q PCR等方法系统地研究玻璃对S.mutans的抑制作用及其机制。结果:1.铜的添加并未改变玻璃的Q结构,且所有玻璃均为无定形结构;玻璃化转化温度T随玻璃中铜含量的增加而降低;2.所有玻璃都具有良好的生物活性;3.低铜含量(≤2 mol%)的玻璃对成骨细胞无细胞毒性;4.FCu BG对S.mutans具有显著的抑制作用,且抗菌性能随玻璃中铜含量的增加而增强;5.FCu BG可显著抑制S.mutans生物膜的形成,并可破坏已形成的生物膜的结构;6.SEM显示含铜BG使S.mutans扭曲变形;TEM显示含铜BG使S.mutans细胞壁溶解消失,细胞膜受损,针状氟磷灰石进入细菌内部沉积,细菌遗传物质被破坏;7.FCu BG显著下调S.mutans胞外多糖的合成(gtf B、gtf C)、群体感应系统(com D、com E)和产酸(ldh)等生物膜形成相关基因的表达。结论:研究表明铜的添加促进了耐酸氟磷灰石的形成且显著提高了玻璃的抗菌性能。FCu BG使S.mutans细胞壁溶解,然后Cu与针状氟磷灰石进一步协同破坏细胞膜的完整性,最终导致细菌的死亡。FCu2BG同时具有良好的生物活性、生物相容性和最佳的抗菌性能,在口腔防龋药物或者护理产品方面具有较好的应用前景。图17幅,表7个,参考文献69篇

关键词：含氟生物活性玻璃铜变异链球菌生物膜抗菌机制龋病

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百药煎合剂对变异链球菌生物膜作用的研究

百药煎合剂对变异链球菌生物膜作用的研究

作者：王祖娇川北医学院

学位级别：硕士

目的:研究三种百药煎合剂对变异链球菌生物膜的形成、消解、产酸、产糖的作用,并比较不同组方效果间的差异,为龋病的预防提供实验参考。方法:用不同浓度梯度的百药煎合剂处理变异链球菌浮游菌,用扫描电镜观察生物膜形态,结晶紫染色法评... 详细信息

目的:研究三种百药煎合剂对变异链球菌生物膜的形成、消解、产酸、产糖的作用,并比较不同组方效果间的差异,为龋病的预防提供实验参考。方法:用不同浓度梯度的百药煎合剂处理变异链球菌浮游菌,用扫描电镜观察生物膜形态,结晶紫染色法评估生物膜量,筛选后续实验药物浓度;用百药煎合剂分别一次和三次处理早期生物膜,采用平板菌落计数法测量菌落数,评估百药煎合剂抗早期生物膜的菌活性;用百药煎合剂处理成熟生物膜,采用扫描电镜观察生物膜形态,死活染色法和激光共聚焦扫描电镜观察生物膜三维立体结构、活死菌分布,并计算活菌比;用乳酸试剂盒法测量变异链球菌生物膜产乳酸量,用蒽酮法测量变异链球菌生物膜产胞外多糖情况。结果:1.1/16较1/32主药浓度的合剂更能抑制生物膜的形成,选择1/16主药浓度作为后续实验浓度。2.三次处理较一次处理更能抑制早期生物膜的菌活性,合剂1、2、3组间无明显差异。3.合剂与对照组相比对成熟生物膜并无明显降低菌活性的作用,也无明显消解作用,合剂1、2、3组间无明显差异。4.合剂2、3组抑制生物膜产酸作用较西帕依对照组强,抑制作用组方间比较:合剂2>合剂1,其他组间无明显差异。5.合剂1、2、3组抑制生物膜产糖作用较西帕依对照组强,抑制作用组方间比较:合剂1>合剂2>合剂3。结论:1.变异链球菌生物膜处于形成的早期阶段时,百药煎合剂能显著降低其菌活性,且增加处理次数效果更好;一旦生物膜成熟后,抵抗力大大增强,百药煎合剂对其无明显抗生物膜活性和消解作用。三个组方间抗生物膜菌活性的作用无明显差异。2.百药煎合剂能抑制生物膜产乳酸和胞外多糖,这对降低变异链球菌生物膜的致龋性有重要意义,组方比较:合剂2抑制产酸效果最好,合剂1抑制产糖效果最好。

关键词：百药煎合剂变异链球菌生物膜龋病

甜菊糖对变异链球菌和白色念珠菌混合生物膜作用和功能的研究

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甜菊糖对变异链球菌和白色念珠菌混合生物膜作用和功能的研究

作者：郭明珠中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

龋病是最常见的口腔疾病,是一种高度流行的生物膜依赖性疾病。长期以来,变异链球菌被认为是龋病的主要病原菌之一,近年来发现白色念珠菌的流行与龋病的发生有很强的相关性,尤其在低龄儿童龋中常发现变异链球菌和白色念珠菌共存。蔗糖是... 详细信息

龋病是最常见的口腔疾病,是一种高度流行的生物膜依赖性疾病。长期以来,变异链球菌被认为是龋病的主要病原菌之一,近年来发现白色念珠菌的流行与龋病的发生有很强的相关性,尤其在低龄儿童龋中常发现变异链球菌和白色念珠菌共存。蔗糖是公认的最易致龋的糖,与龋病的流行有直接关系,寻找蔗糖替代品一直是龋病预防策略之一,而人造甜味剂常常存在一定的健康危害。甜菊糖是天然高甜度甜味剂,已有研究证实甜菊糖能够抑制变异链球菌生物膜形成和酸的产生、降低致龋菌活力、抑制牙釉质脱矿。然而多数研究聚焦单种生物膜,实验内容和评价指标较为单一,因此,其推广和应用需要更加完善、更有深度的生物膜模型去验证。本研究中,首先通过比较患重度低龄儿童龋(severe early childhood caries,S-ECC)儿童和健康无龋儿童唾液中变异链球菌和白色念珠菌的差异,验证白色念珠菌的致龋相关性,其次构建变异链球菌和白色念珠菌的混合生物膜模型,探索甜菊糖对混合生物膜的作用效果,并以蔗糖为背景,评估混合糖作用下是否改变甜菊糖的作用效果。最后,基于RNA测序转录组学,评估甜菊糖对混合生物膜的致龋毒力基因和分子途径的影响,探索甜菊糖对混合生物膜的作用机制。实验一重度低龄儿童龋唾液中变异链球菌和白色念珠菌宏基因组学分析【目的】通过宏基因组学测序,分析患有重度低龄儿童龋(S-ECC)和健康(Healthy)儿童口腔中变异链球菌和白色念珠菌的差异。【方法】选择3–6岁儿童作为研究对象,根据WHO龋病检测标准,分为S-ECC组和Healthy组,采集唾液和临床基本信息,进行宏基因组学分析。【结果】1.纳入42名儿童,S-ECC组平均龋失补牙数为15.56±2.89,平均龋失补牙面数为37.30±12.61,患龋数目最多的牙位是上下颌第二乳磨牙。2.宏基因组学研究结果发现,S-ECC组和Healthy组唾液微生物群落在门和属水平上高度重叠,但组成结构多样性方面有统计学差异。3.S-ECC组和Healthy组唾液中变异链球菌和白色念珠菌检出率为100%,两组之间变异链球菌和白色念珠菌的相对丰度差异无统计学意义(P>0.05),但变异链球菌和白色念珠菌存在较高的正相关关系(r=0.840,P变异链球菌和白色念珠菌的相对丰度在不同患龋状态下均无差异,但两种菌之间存在正相关关系。实验二甜菊糖对变异链球菌和白色念珠菌混合生长和生物膜形成的影响【目的】探索甜菊糖对变异链球菌和白色念珠菌混合浮游生长、生物膜的生长和产酸、形态结构和活性功能的影响。【方法】1.培养变异链球菌(S.mutans UA159)和白色念珠菌(C.albicans SC5314),配制含1%甜菊糖(1%Ste)、与1%蔗糖同甜度甜菊糖(Ste)、1%木糖醇(1%Xy)、1%蔗糖(1%S)、1%蔗糖+1%甜菊糖(1%S+1%Ste)的TSB培养基及未添加任何糖的空白TSB培养基。2.通过浮游状态测量吸光度检测甜菊糖对混合菌悬液浮游生长的影响;通过结晶紫染色观察并定量分析甜菊糖对混合生物膜生长的影响;通过p H值检测甜菊糖对混合生物膜产酸的影响;通过扫描电镜观察混合生物膜的形态结构特点;通过活死菌染色和平板计数检测甜菊糖对混合生物膜活性的影响,并通过Image J计算活性抑制率;通过胞外多糖和细菌真菌特异性染色观察甜菊糖对混合生物膜胞外多糖合成的影响。【结果】1.与1%S和1%S+1%Ste组相比,1%Ste和Ste组抑制混合浮游生长、混合生物膜生长和产酸、混合生物膜变异链球菌的活力(P0.05)。2.与TSB组相比,1%Ste和Ste组对混合浮游生长、混合生物膜生长和产酸、混合生物膜活性抑制率和变异链球菌的活力没有显著影响(P>0.05)。3.与1%Xy组相比,1%Ste组混合生物膜生长显著降低(P变异链球菌的活力没有显著影响(P>0.05)。4.从扫描电镜和共聚焦激光显微镜观察,与1%S相比,1%Ste和Ste组变异链球菌和白色念珠菌数量较少,菌落最小,白色念珠菌酵母相居多,结构较为稀疏,立体结构不明显,活细胞和死细胞基本重叠,对混合生物膜胞外多糖的产生有明显的抑制作用。【结论】与蔗糖相比,甜菊糖抑制变异链球菌和白色念珠菌混合生长和产酸,抑制混合生物膜的三维结构和胞外基质的形成,抑制混合生物膜的活性和胞外多糖的产生。但在蔗糖背景下,甜菊糖的抑制作用明显减弱。实验三甜菊糖对变异链球菌和白色念珠菌混合生物膜转录的影响【目的】通过转录组学测序,探索甜菊糖对混合生物膜致龋基因表达的影响。【方法】配制含1%蔗糖、1%木糖醇、1%甜菊糖的TSB培养基及未添加任何糖的TSB培养基。将变异链球菌和白色念珠菌接种于不同培养基中形成混合生物膜,提取混合生物膜的RNA,进行转录组学测序及分析。【结果】

关键词：变异链球菌白色念珠菌龋病甜菊糖生物膜

基于ZIF-8的光动力纳米抗菌材料对变异链球菌及其生物膜的抗菌作用研究

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基于ZIF-8的光动力纳米抗菌材料对变异链球菌及其生物膜的抗菌作...

作者：王瑞凤吉林大学

学位级别：硕士

背景及目的:变异链球菌是引起龋病的主要致病菌,通过形成菌斑生物膜导致龋病发生。抗菌光动力疗法(a PDT)具有显著的治疗效果且不易产生耐药性,是预防细菌感染性口腔疾病的有效方法。沸石咪唑骨架-8(ZIF-8)由于具有孔隙率高、酸响应降... 详细信息

背景及目的:变异链球菌是引起龋病的主要致病菌,通过形成菌斑生物膜导致龋病发生。抗菌光动力疗法(a PDT)具有显著的治疗效果且不易产生耐药性,是预防细菌感染性口腔疾病的有效方法。沸石咪唑骨架-8(ZIF-8)由于具有孔隙率高、酸响应降解及生物相容性好等优点,因此可作为药物输送载体被广泛应用于抗菌领域。本研究利用ZIF-8的优良特性,制备了一种载氧的纳米复合材料O-Cu/ZIF-8@Ce6/ZIF-8@HA(OCZCH),通过a PDT研究其对变异链球菌及其生物膜的抗菌作用和对变异链球菌致龋毒力的影响,以期为细菌感染性口腔疾病的预防与治疗提供新思路。方法:1.合成掺杂Cu的ZIF-8(Cu/ZIF-8),载O后,在其外表面包覆一层负载小分子光敏剂Ce6的ZIF-8,合成O-Cu/ZIF-8@Ce6/ZIF-8(OCZC),然后将具有良好生物相容性的透明质酸(HA)组装到其表面,最终合成具有高效抗菌能力的OCZCH纳米复合材料。2.应用X射线衍射(XRD)、透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、Zeta电位、紫外-可见分光光度仪(UV-Vis)、X射线光电子能谱(XPS)、全自动比表面积及孔隙度分析仪(BET)以及体外活性氧(ROS)测定等对材料的物化性质进行结构表征。3.CCK-8实验测定OCZCH对L929小鼠成纤维细胞的生物相容性。4.测定OCZCH对变异链球菌的最小抑菌浓度(MIC)。5.结晶紫染色、MTT实验、细菌活/死染色和SEM研究Control组、Ce6组、CZCH组、OCZCH组分别在650 nm激光(5 min、120 m W/cm,记为“+”)和暗处理(记为“-”)下对变异链球菌生物膜的抑制作用。6.产酸实验和胞外多糖实验测定Control组、Ce6组、CZCH组、OCZCH组分别在650 nm激光和暗处理下对变异链球菌致龋毒力的影响。结果:1.材料表征实验显示OCZCH成功合成。TEM和SEM图像显示OCZCH纳米粒子大小约170 nm,分散均匀,无团聚现象;HAADF-STE证明C、N、Cu、Zn、O元素均匀分布在OCZCH纳米颗粒中;XRD显示OCZCH具有良好的ZIF-8晶型;Zeta电位证明材料修饰HA后呈明显的负电荷,证明HA成功修饰;XPS测定了掺杂的Zn和Cu电子能谱,932.4e V和952.1e V处的峰值分别属于Cu的Cu(2p)和Cu(2p)电子能谱;氧气吸附等温线测定实验显示Cu/ZIF-8的载氧能力是ZIF-8的2倍;UV-Vis吸收光谱图可见在负载了含Ce6的ZIF-8外壳后,在410 nm和640 nm处出现了明显的Ce6的特征性吸收峰;根据Ce6浓度标准曲线可计算出OCZCH中Ce6的负载率为3.2 wt%;BET分析材料孔径显示Cu/ZIF-8@Ce6/ZIF-8(CZC)较ZIF-8的表面积、孔体积和孔径均有所下降,证明Ce6被包覆在ZIF-8中;酸响应药物释放实验表明在微酸环境下,OCZCH骨架崩解坍塌,可快速释放包裹的Ce6,具有良好的酸响应性;ROS生成检测证明OCZCH在650 nm红光照射下产生了单线态氧。2.CCK-8实验显示OCZCH具有良好的生物相容性,无明显细胞毒性。3.OCZCH对变异链球菌的MIC为50μg/m L。4.Control、Ce6、CZCH、OCZCH分别在650 nm激光(5 min,120 m W/cm)和暗处理下对变异链球菌生物膜形成的抑制作用:(1)生物膜形成量:暗处理时,各组生物膜形成量无明显差异;光照时,各组对生物膜的抑制效果为:OCZCH+组>CZCH+组>Ce6+组>Control+组。(2)生物膜代谢活性:暗处理时,各组生物膜代谢活性基本无变化;光照时,各组对生物膜代谢活性的抑制效果为:OCZCH+组>CZCH+组>Ce6+组>Control+组。(3)细菌活/死染色:Control+组和暗处理组细菌生物膜致密,呈现大面积绿色荧光(活细菌);CZCH+和Ce6+组有一定的抑菌作用,生物膜稀疏,呈现橙色;OCZCH+组红色荧光(死细菌)占据主导,抗菌作用明显。(4)生物膜形态:SEM下放大相同倍数时,暗处理组和Control+组均显示出较为完整致密的生物膜;Ce6+组显著破坏了生物膜的致密性和完整性,降低了其厚度,生物膜分离成碎片状;CZCH+组显示出较为明显的抑制细菌聚集的现象;OCZCH+组未见生物膜形态,仅见少量分散的细菌。5.Control、Ce6、CZCH、OCZCH分别在650 nm激光和暗处理下对变异链球菌致龋毒力的影响:(1)产酸抑制能力:暗处理时,各组对变异链球菌无产酸抑制能力;光照时,各组对变异链球菌产酸能力的抑制率大小排序为:OCZCH+组>CZCH+组>Ce6+组>Control+组;OCZCH+组的抑制率高达87.4%。(2)胞外多糖实验:暗处理时,各组胞外多糖产生量基本无变化

关键词： ZIF-8 抗菌光动力疗法纳米材料变异链球菌生物膜

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蜂胶抑制变异链球菌作用及机理研究

蜂胶抑制变异链球菌作用及机理研究

作者：袁洁聊城大学

学位级别：硕士

龋病是全球广泛流行的细菌感染性疾病,严重威胁着人们的口腔健康。变异链球菌（Streptococcus mutans）是公认的致龋细菌,其最早定植于牙齿表面,分泌葡糖转移酶（GTF）合成胞外多糖（EPS）,形成牙菌斑。目前防治龋病的药物主要是化学药... 详细信息

龋病是全球广泛流行的细菌感染性疾病,严重威胁着人们的口腔健康。变异链球菌（Streptococcus mutans）是公认的致龋细菌,其最早定植于牙齿表面,分泌葡糖转移酶（GTF）合成胞外多糖（EPS）,形成牙菌斑。目前防治龋病的药物主要是化学药物,该类药物毒性大,且长期使用会导致细菌耐药性增强,药效降低。因此新型安全抗菌药物的研发迫在眉睫。蜂胶具有广谱抗菌活性,到目前为止,蜂胶及其精油的抗S.mutans功效鲜有报道,基于此,本研究以蜂胶及其精油为研究对象,对其抗S.mutans作用与机理进行了系统研究。同时为解决精油的易挥发和易氧化等问题,我们又构建了蜂胶精油微乳液体系,并对其抗S.mutans作用与机理进行了研究。主要研究结果如下:（1）首先筛选了山东省不同地区蜂胶的抑菌活性,结果显示5号蜂胶对S.mutans抑制作用最为显著,其抑菌圈直径（DIZ）、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）分别为17.33 mm、0.25 mg/m L和0.5 mg/m L;结晶紫（CV）染色和XTT还原实验显示该蜂胶能显著减少S.mutans成熟生物膜的生物量和活性,表明蜂胶对S.mutans浮游菌和生物膜皆具有抗性。（2）采用水蒸气蒸馏法和气相色谱-质谱法（GC-MS）对蜂胶精油进行提取和成分鉴定,共鉴定出79种成分,占总成分的98.24%,其中含量最多的3种成分分别为:β-雪松烯（13.94%）、α-姜黄烯（11.28%）和α-香柠檬烯（4.5%）。抗菌活性实验显示蜂胶精油对S.mutans的DIZ、MIC、MBC分别为24.5 mm、0.625μL/m L、1.8μL/m L。通过生长曲线实验证实蜂胶精油显著抑制S.mutans生长。CV和XTT实验表明蜂胶精油对S.mutans生物膜具有显著抑制作用。乳酸脱氢酶（LDH）、Ca和Live/Dead荧光染色实验表明蜂胶精油能够破坏生物膜内细菌结构的完整性。扫描电镜（SEM）和细菌粘附实验证实蜂胶精油显著抑制S.mutans的粘附聚集,导致生物膜结构松散。EPS和GTF实验表明蜂胶精油可通过抑制GTF的活性减少胞外多糖的合成,抑制细菌的粘附聚集,进而具有抗生物膜功效。（3）本研究通过伪三元相图构建了蜂胶精油微乳液体系。通过测定电导率、粘度、粒径等检测表明蜂胶精油微乳液具有稳定的理化性质。同时对蜂胶精油微乳液的抗S.mutans活性进行了系统研究,结果表明,蜂胶精油微乳液的抗菌活性与蜂胶精油类似。其抗S.mutans浮游菌活性实验表明其具有显著的抑菌功效,其DIZ、MIC、MBC分别为31 mm、2.5μL/m L、10μL/m L。Live/Dead荧光染色和SEM实验表明蜂胶精油微乳液对S.mutans的细菌细胞结构和生物膜的整体结构都具有显著影响。CV、XTT实验表明蜂胶精油微乳液显著抑制生物膜。LDH、Ca实验也证实蜂胶精油微乳液对生物膜内细菌的细胞结构的破坏作用显著。细菌粘附、EPS和GTF实验表明蜂胶精油微乳液可以通过抑制GTF的活性减少胞外多糖的合成而抑制细菌的粘附聚集。

关键词：蜂胶蜂胶精油蜂胶精油微乳液变异链球菌生物膜

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栖牙普氏菌与变异链球菌协同致龋的探索研究

栖牙普氏菌与变异链球菌协同致龋的探索研究

作者：牛玉芬大连医科大学

学位级别：硕士

1.背景与目的:龋病是最常见的口腔疾病之一,具有发生率高且逐年上升的特点,是一个全球关注的公共卫生问题。龋病是在以细菌为主的多种因素共同作用下发生的一种牙体慢性感染性疾病,因此探索龋病的病因微生物学及其作用机制具有重要的意... 详细信息

1.背景与目的:龋病是最常见的口腔疾病之一,具有发生率高且逐年上升的特点,是一个全球关注的公共卫生问题。龋病是在以细菌为主的多种因素共同作用下发生的一种牙体慢性感染性疾病,因此探索龋病的病因微生物学及其作用机制具有重要的意义。口腔致病菌多以生物膜的生态形式存在,生物膜内不同种属细菌间通过信号分子或直接接触相互联系,并对各自生理特性及致龋毒性产生影响。其中变异链球菌由于其较强的产酸、耐酸能力以及合成多种胞外多糖的特性,一直以来被认为是主要的致龋菌之一,也是菌斑生物膜的主要成分。但龋病本质上是由菌斑微生态失衡引起的,每个菌种在龋病发生过程中发挥的作用都不容忽视,课题组前期测序研究发现高龋儿童口腔菌群中栖牙普氏菌与变异链球菌的相对丰度显著增高,揭示了栖牙普氏菌与龋病具有强相关性。然而,栖牙普氏菌参与致龋的作用机制及其与变异链球菌在菌斑生物膜中的相互关系仍不清楚。本课题基于栖牙普氏菌、变异链球菌以及两菌共生体系,分别从细菌代糖产酸、形成生物膜能力、致牙釉质脱矿及致龋相关基因表达四个方面展开,探究栖牙普氏菌在致龋过程中的作用及其与变异链球菌共生在菌斑生物膜的相互关系,完善龋病的病因微生物学,为龋病的有效防治提供研究基础。2.方法:2.1细菌代糖产酸能力检测为了检测栖牙普氏菌、变异链球菌以及两菌共生的代糖产酸能力,将上述菌液分别在相同条件下培养并按时间梯度定点取样,使用p H计检测培养基质的p H值,并采用高效液相色谱法对培养基上清进行代谢成分分析,计算上清液中葡萄糖、蔗糖、代谢产物乳酸含量以及p H值随培养时间的变化。2.2细菌形成生物膜能力检测将相同浓度的栖牙普氏菌、变异链球菌以及两菌混合培养液分别置于96孔板或24孔板中,在37℃厌氧条件下培养以形成细菌生物膜,采用结晶紫染色法定量检测形成的生物膜总量;生物膜经过固定、脱水、喷金等一系列处理,使用扫描电镜观察生物膜的形态结构;进一步,用荧光染料将生物膜染色后,在共聚焦显微镜下观察生物膜内各菌群以及胞外基质的分布,并构建生物膜的三维空间结构,计算各菌种形成生物膜的厚度。2.3细菌致釉质脱矿能力检测收集人类拔除的第三磨牙,挑取牙冠表面完整、无龋齿、隐裂及修复体的牙齿,经过一系列处理后选取均匀一致的牙釉质块,将牙釉质块分别与栖牙普氏菌、变异链球菌以及两菌混合菌液在相同条件下共培养,建立体外致龋模型,利用显微维氏硬度计测量牙釉质表面的维氏硬度值,并在显微镜下观察釉质表面的微结构。2.4变异链球菌中致龋相关基因表达分析为了研究栖牙普氏菌对变异链球菌的糖代谢相关基因gtfs以及黏附相关基因gbp B表达的影响,分别获取变异链球菌单菌和两菌共生生物膜,提取细菌总的RNA,再经过逆转录、PCR扩增后,采用2方法对结果进行分析。3.结果:3.1随培养时间,栖牙普氏菌、变异链球菌以及两菌共培养基质中葡萄糖和蔗糖都在逐渐被消耗,代谢糖的结果导致乳酸和果糖含量增加,从而所测量的p H值逐渐降低;与变异链球菌相比,栖牙普氏菌中葡萄糖、蔗糖的消耗以及乳酸的产生速率明显较慢（P变异链球菌间无明显差异（P>0.05）,分泌代谢产物乳酸的含量明显增多（P变异链球菌均能黏附于玻片或孔板表面形成生物膜。结晶紫染色结果显示相比于变异链球菌,栖牙普氏菌形成的生物膜量较少,体现在较小的OD值（P变异链球菌那样呈团簇状分布;然而,两菌共生生物膜的结构更加复杂,生物膜内分布有密集的微菌落和丰富的细胞外基质,而且,两菌共生生物膜的厚度也最大（P变异链球菌及两菌共生均可以诱导牙釉质表面的微硬度和微结构有明显的变化,提示栖牙普氏菌和变异链球菌均有致龋能力;与栖牙普氏菌相比,变异链球菌诱导的牙釉质表面硬度和结构的变化更明显（P变异链球菌中与碳水化合物代谢密切相关的基因gtf B、gtf C和gtf D的相对表达量分别上调34%、39%和40%;与细菌黏附相关基因gbp B m RNA的水平显著升高1.68倍,提示栖牙普氏菌可以协同变异链球菌增强致龋作用。4.结论:在本课题中,我们发现栖牙普氏菌可以附着于釉质表面形成生物膜,并可在体外发酵葡萄糖、蔗糖产酸,促使牙釉质脱矿,表明栖牙普氏菌本身具有致龋能力,但其致龋能力弱于经典致龋菌变异链球菌。进一步在两菌共生体系下,栖牙普氏菌可促进变异链球菌代谢碳水化合物产酸,增加菌群间黏附性,有利于生物膜的形成,并加速牙釉质的脱矿,通过体外实验揭示了栖牙普氏

关键词：龋病牙菌斑栖牙普氏菌变异链球菌生物膜