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食品科学 2024年

作者：戴永进孙静张莫然刘玉娟陈洪周陆颖健安徽国泰众信检测技术有限公司南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心

食源性致病微生物是食品安全的一大严重威胁，传统的生化检测手段面临着一系列挑战。近年来，随着CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术的逐步发展，具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系受到了越来越... 详细信息

食源性致病微生物是食品安全的一大严重威胁，传统的生化检测手段面临着一系列挑战。近年来，随着CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术的逐步发展，具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系受到了越来越多的关注。本文综述了具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系的起源与分类，并详细介绍了具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系的作用原理。同时，本文对反式切割CRISPR/Cas体系在食源性致病微生物领域的多方面应用进行了综述，并讨论了该技术的优劣和未来发展方向。

关键词： CRISPR/Cas 反式切割食源性致病菌核酸检测

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CRISPR-Cas12a反式切割活性及其在miRNA检测的研究

CRISPR-Cas12a反式切割活性及其在miRNA检测的研究

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作者：李佳成中南大学

学位级别：硕士

CRISPR-Cas12a系统具有在cr RNA指导下的靶DNA激活的非特异性的ss DNA切割活性,即反式切割活性,且该活性比较高效,因此已成为体外诊断应用的研究热点。虽然对其反式切割活性有较多的研究,但是仍存在一些不足之处,如靶标特异性、底物特... 详细信息

CRISPR-Cas12a系统具有在cr RNA指导下的靶DNA激活的非特异性的ss DNA切割活性,即反式切割活性,且该活性比较高效,因此已成为体外诊断应用的研究热点。虽然对其反式切割活性有较多的研究,但是仍存在一些不足之处,如靶标特异性、底物特异性及对不同底物的切割速度等,还需要进一步研究。此外,循环逆转录CRT具有快速、特异性高的特点,将其与CRISPR-Cas12a系统结合,有望解决现有mi RNA检测技术的缺陷,实现更特异、高效、灵敏的检测。故本文拟结合CRISPR-Cas12a系统与荧光分析,对其反式切割活性进一步补充;结合CRISPR-Cas12a系统与CRT等温扩增技术,通过荧光分析构建对mi RNA的检测平台。综上,本文主要进行了两部分研究:(1)本文首次证明了Lb Cas12a系统与目标ss DNA结合也可以反式切割一定长度的线性ss RNA,而且目标ss DNA或ss RNA都可以触发Lb Cas12a系统反式切割RNA或DNA发夹底物。同时随着底物类型的改变,Lb Cas12a-cr RNA-目标ss DNA复合物和Lb Cas12acr RNA-目标ss RNA复合物对其显示不同的反式切割活性。另外确定了Lb Cas12a系统对DNA和RNA的检测能力。使用荧光发卡DNA作为报告探针,在1小时的切割实验中对目标mi RNA-21类似物和mi RNA-21的检测限分别为5 p M和50 p M。这些工作进一步扩充了对CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性的了解。(2)为了提高mi RNA检测系统的灵敏度和特异性,需要将核酸放大手段与CRISPR-Cas12a系统进行耦合。本文选择已被证明具有高特异性的循环逆转录CRT,结合CRISPR-Cas12a系统构建了对mi RNA的通用的、高灵敏的、高特异性的体外检测平台。在最优的条件下,该系统对mi RNA-21的检测下限达到了0.463 f M,较CRISPR-Cas12a系统的灵敏度提高了5个数量级。通过简单更换可变引物中的部分序列,这种方法对mi RNA-1a和mi RNA-122的检测下限分别达到0.876 f M和0.201 f M,验证了CRISPR-CRT系统的通用性,另外CRISPR-CRT系统也表现出单碱基特异性,该系统扩展了mi RNA的体外检测平台。图37幅,表6个,参考文献104篇

关键词： CRISPR-Cas12a 反式切割发卡微小RNA

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CRISPR/Cas系统在食源性致病菌快速检测新技术中的研究进展

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食品科学 2023年第7期44卷 313-323页

作者：寇秀颖周宝青陈玲代京莎张菊梅吴清平无限极(中国)有限公司广东广州510405 广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省微生物安全与健康重点实验室农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室广东广州510070

食源性致病菌的早期筛查与快速检测对食品安全和临床诊断至关重要。然而,传统检测方法操作繁琐、费时费力,难以满足快速检测需求。成簇、规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)... 详细信息

食源性致病菌的早期筛查与快速检测对食品安全和临床诊断至关重要。然而,传统检测方法操作繁琐、费时费力,难以满足快速检测需求。成簇、规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和关联蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR/Cas是广泛存在于细菌和古细菌中的一种免疫系统,其高效特异序列识别及切割活性的特性,为食源性致病菌高灵敏、快速检测提供了一种新的途径。本文介绍了CRISPR/Cas系统的原理、机制及发展,总结了近年来基于CRISPR/Cas系统结合不同结果报告方式用于食源性致病菌快速检测的最新进展,并对其优势、局限性和未来发展方向进行了讨论。

关键词： CRISPR/Cas 食源性致病菌反式切割快速检测技术

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基于CRISPR/Cas系统的生物传感器研究进展

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山东化工 2023年第17期52卷 111-113,117页

作者：李倩范高超青岛科技大学化学与分子工程学院山东青岛266042

聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关酶(Cas)统称为CRISPR/Cas系统,在许多方面彻底改变了生物学和生物医学研究。CRISPR/Cas系统作为识别和操纵核酸的强大分子机器之一,具有极强的信号放大能力和基因编辑能力。近几年,开发... 详细信息

聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关酶(Cas)统称为CRISPR/Cas系统,在许多方面彻底改变了生物学和生物医学研究。CRISPR/Cas系统作为识别和操纵核酸的强大分子机器之一,具有极强的信号放大能力和基因编辑能力。近几年,开发了许多基于CRISPR/Cas系统的检测方法用于临床诊断、生物传感和生物成像等领域。通过国内外的研究现状,对CRISPR/Cas系统的几种常见种类及其在生物传感中的应用研究进行概述,为CRISPR/Cas系统在核酸检测以及分子诊断等方面地进一步研究提供了理论基础。

关键词： CRISPR/Cas系统反式切割生物传感

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基于CRISPR-Cas12a的端粒酶一步法检测新技术研究

基于CRISPR-Cas12a的端粒酶一步法检测新技术研究

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作者：余沛航重庆医科大学

学位级别：硕士

端粒酶作为能调控真核生物端粒长度的DNA蛋白酶复合物,其活性与多种肿瘤的进程相关,因而被认为是一种新兴的肿瘤诊断标志物。因此,迫切需要一种简便、快速、灵敏并具有床旁诊断(POC)潜力的检测端粒酶活性的方法。在此,我们建立了一种基... 详细信息

端粒酶作为能调控真核生物端粒长度的DNA蛋白酶复合物,其活性与多种肿瘤的进程相关,因而被认为是一种新兴的肿瘤诊断标志物。因此,迫切需要一种简便、快速、灵敏并具有床旁诊断(POC)潜力的检测端粒酶活性的方法。在此,我们建立了一种基于端粒合成激活的CRISPR-Cas12a系统一体化检测端粒酶活性的方法。端粒酶延伸反应产生端粒重复序列(TTAGGG),同时被一个定制的CRISPR引导RNA(cr RNA)识别,最后激活了的基于Cas12a-cr RNA的反式切割活性恢复荧光探针信号。由于CRISPR-Cas12a固有的灵敏度,这种方法在100到2000个He La细胞范围之间实现了很好的线性回归,并且检测限可达到26个He La细胞。此外,该方法可以在恒温(37℃)条件下,通过一个简单快速的工作流程(一小时内一个步骤)在一个反应体系中检测端粒酶。由于其优异的性能,这种一体化的方法在床旁检测端粒酶活性方面显示出巨大的潜力。

关键词：端粒酶活性 CRISPR-Cas12a 反式切割一体化床旁诊断

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一种基于邻近延伸和转录释放的自供给crRNA整合CRISPR/Cas12a系统的通用的核酸检测策略

一种基于邻近延伸和转录释放的自供给crRNA整合CRISPR/Cas12a系统...

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作者：田国振海南医学院

学位级别：硕士

目的:建立一种基于CRISPR/Cas12a系统,但不依赖于必须含有TTTN序列的目标核酸,并且不需要多次设计crRNA的通用的核酸检测的新方法,实现对核酸快速、简单、灵敏的检测。方法:我们设计了延伸探针和模板探针两种探针,当目标DNA存在时,目标... 详细信息

目的:建立一种基于CRISPR/Cas12a系统,但不依赖于必须含有TTTN序列的目标核酸,并且不需要多次设计crRNA的通用的核酸检测的新方法,实现对核酸快速、简单、灵敏的检测。方法:我们设计了延伸探针和模板探针两种探针,当目标DNA存在时,目标DNA被识别并结合到这对相邻的探针上,然后触发近距离结合和延伸,延伸出含有T7 RNA聚合酶的启动子序列。T7 RNA聚合酶通过识别其特定的启动子,进而启动转录扩增,产生大量的单链crRNA产物。随后,将这含有PAM序列的dsDNA探针和Cas12a蛋白加入上述的缓冲液中组装形成三联体,激活Cas12a的反式剪切特性,不断地切割标记有FAM荧光基团和BHQ-1的猝灭基团的ssDNA报告探针,从而产生强烈的荧光信号。并且通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光强度验证这个过程。结果:(1)通过荧光光谱我们看到可以看到阳性样本有一个很强烈的荧光信号而阴性只有极小的荧光信号。通过PAGE电泳,我们看到了转录出的RNA条带以及Cas12a被激活后成功剪切ss DNA,这些结果验证了Cas12a的反式切割活性以及整个实验方案的可行性。(2)我们进行了一系列实验条件的优化,确定了最优条件包括延伸探针和模板探针之间的碱基互补个数为6个、T7 RNA聚合酶的浓度为30U、转录扩增的时间为3个小时、Cas12a的浓度为50n M以及Cas12a对单链DNA反式切割的时间为60分钟。(3)我们在最佳的实验条件下进行了实验的性能分析,在500 fM～100 pM得到了一个线性方程为F=22.373 lg C-30.270,相关系数为0.995。(4)我们又分析了实验方法的特异性、重复性、通用性以及抗干扰能力,结果表明本方法具有良好的特异性、重复性、通用性以及抗干扰能力。结论:我们成功建立了一种基于邻近延伸和转录扩增的自供给crRNA整合CRISPR/Cas12a系统,实现了对核酸快速、简单、灵敏的检测方法。该方法具有良好的重复性、特异性和抗干扰性。此外,还具有以下优点;1,摆脱了Cas12a只能识别含有PAM序列的目标核酸的缺陷;2不需要多次设计crRNA来激活Cas12a;3,可以用于广泛的DNA/RNA序列的一般检测,拓宽了Cas12a系统在核酸检测领域方面的应用。

关键词：成簇的、规律间隔的短回文重复序列原间隔邻近基序反式切割邻位结合荧光传感核酸检测

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