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反向杂交法检测乙型肝炎病毒3种核苷（酸）类似物耐药突变

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中华肝脏病杂志 2010年第6期18卷 414-418页

作者：刘彦辰张文露胡源赵丽赖国旗胡接力杨凤黄爱龙重庆医科大学病毒性肝炎研究所、教育部感染性疾病分子生物学重点实验室 400016

目的建立一种同时检测HBV 3种核苷（酸）类似物耐药突变的方法.方法以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,设计2对地高辛标记的通用引物,扩增HBV聚合酶的逆转录区.针对拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦10个耐药位点上的氨基酸替换形式,... 详细信息

目的建立一种同时检测HBV 3种核苷（酸）类似物耐药突变的方法.方法以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,设计2对地高辛标记的通用引物,扩增HBV聚合酶的逆转录区.针对拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦10个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计26条特异性寡核苷酸探针,包括I169T,V173L/G,L180M,A181T/V,T184G,S202I/G,M204V/I,Q215S,N236T,M250V/I/L,并固定于带正电荷的尼龙膜上.利用地高辛标记的靶DNA扩增产物与固定于膜上的特异性探针的反向杂交,检测HBV 3种核苷（酸）类似物的耐药突变.应用反向杂交法分别检测HBV野生和耐药标准株,以及40例患者血清标本,观察其检测特异性和准确性.结果反向杂交法检测HBV野生和耐药标准株,有效地区分了1169T,V173L,L180M,A1811T,T184G,S202I,M204V,Q215S,N236T,M250V 10个耐药位点上的特异性探针.40例患者血清标本中,37例临床病例的耐药检测结果与直接测序法一致.结论反向杂交法可以快速,准确的检测出HBV3种核苷类似物耐药突变,有助于这3种药物耐药的诊断和个体化治疗.

关键词：肝炎病毒,乙型抗药性,自然核苷(酸)类反向杂交

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克隆化反向杂交探针的制备

生物化学与生物物理进展 1996年第3期23卷 273-278页

作者：李卫国栾旭东黄涛朱宁宁秦学斌黄尚志龙桂芳沈岩吴冠芸中国医学科学院基础医学研究所

反向斑点杂交是将寡核苷酸探针固定在膜上，用标记的靶序列与固定在膜上的探针进行杂交．与正向杂交相比，它通过一次杂交即可确定多种基因型，是一种快速筛查ＤＮＡ点突变的诊断方法我们选择β－地中海贫血基因－２８（Ａ→Ｇ）、ＣＤ... 详细信息

反向斑点杂交是将寡核苷酸探针固定在膜上，用标记的靶序列与固定在膜上的探针进行杂交．与正向杂交相比，它通过一次杂交即可确定多种基因型，是一种快速筛查ＤＮＡ点突变的诊断方法我们选择β－地中海贫血基因－２８（Ａ→Ｇ）、ＣＤ１７（Ａ→Ｔ）、ＣＤ４１～４２（－ＴＴＣＴ）三种点突变为模型采用ＰＣＲ扩增产生串联多拷贝序列探针并将其克隆化．将克隆化探针固定于尼龙膜上，与同位素标记的β－珠蛋白基因ＰＣＲ片段进行杂交，检测β－地贫患者的基因型．

关键词：反向杂交探针制备克隆 β-地中海贫血

聚合酶链反应-反向杂交快速检测巨细胞病毒糖蛋白gB、gH基因型变异

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中华微生物学和免疫学杂志 2002年第4期22卷 456-460页

作者：周琳钱景蔡挺马伟杭郑树森 U.Ullmann P.Rautenburg T.C.Harder 浙江大学医学院附属一院浙江大学医学院微生物教研室 Institute of Medical Microbiology and Virology Kiel UniversityGermany

目的　建立一种简便、快速、敏感和特异的检测巨细胞病毒 (HCMV)糖蛋白gB、gH基因型变异的方法。方法　以HCMV糖蛋白基因gH、gBn、gBclv为靶序列 ,设计 17条具有型特异性的寡核苷酸探针 ,聚合酶链反应 (PCR)扩增目的片段 ,反向杂交检测 ... 详细信息

目的　建立一种简便、快速、敏感和特异的检测巨细胞病毒 (HCMV)糖蛋白gB、gH基因型变异的方法。方法　以HCMV糖蛋白基因gH、gBn、gBclv为靶序列 ,设计 17条具有型特异性的寡核苷酸探针 ,聚合酶链反应 (PCR)扩增目的片段 ,反向杂交检测 2 3例中国和 6例德国移植患者HCMVgH、gBn、gBclv基因型变异 ,其结果与直接测序进行比较。结果　 2 3例中国患者HCMV糖蛋白为gH1和 2型 ,gB1、2和 3型 ,未见gB4型 ;而 6例德国患者的HCMV糖蛋白涵盖gH1和 2型 ,gB1、2、3及 4型。中、德两国患者均可同时感染 2种不同基因型的病毒株。反向杂交技术对检测患者同时感染不同基因型病毒株优于直接测序。结论　PCR 反向杂交技术具有简便、快速、敏感和特异的特点 ,适用于临床实验室检测HCMV糖蛋白基因型变异。

关键词：糖蛋白基因型变异人类巨细胞病毒聚合酶链反应反向杂交 gB基因 gH基因免疫学检测

反向杂交检测肝癌相关乙型肝炎病毒前C区突变方法的建立和应用

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中国癌症杂志 2014年第4期24卷 266-272页

作者：赵芝梅朱宇吴燕樊春笋陈陶阳甘愉屠红上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室上海200032 启东肝癌防治研究所启东肿瘤医院病因室江苏启东226200

背景与目的：日益增多的研究表明，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）DNA前C区G1896A和G1899A突变是肝癌发生的危险因素。本研究旨在建立简单、快速、灵敏和准确的检测HBV前C区突变的反向杂交方法，并应用于检测江苏省启东地区HBV... 详细信息

背景与目的：日益增多的研究表明，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）DNA前C区G1896A和G1899A突变是肝癌发生的危险因素。本研究旨在建立简单、快速、灵敏和准确的检测HBV前C区突变的反向杂交方法，并应用于检测江苏省启东地区HBV DNA前C区突变与肝癌发生的关系。方法：设计并合成HBV DNA前C区1896和1899位点的特异性探针，通过优化条件建立特异、敏感的杂交体系，并与直接测序检测结果进行比较。将该方法应用于检测启东100例肝癌和100例慢性HBV携带者（对照组），分析HBV DNA前C区突变与肝癌的关系。结果：反向杂交对血清样本的最低检测下限为HBV DNA 103 copy/mL，检测混合感染时比直接测序更占优势，混合株中10％以上的突变株均可被检测。启东地区HBV DNA前C区G1899A突变与肝癌高发具有相关性（P=0.000, OR=4.846, 95%CI：2.240～10.485），而G1896A突变未见其相关性。结论：反向杂交检测HBV DNA前C区突变方便、快速、准确，可有效监控肝癌的发生，适合临床大规模推广应用。

关键词：乙型肝炎病毒前C区反向杂交突变肝癌

反向杂交检测HBV耐药突变方法的建立及评估

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反向杂交检测HBV耐药突变方法的建立及评估

作者：刘彦辰重庆医科大学

学位级别：硕士

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)一直以来就威胁着全人类的健康,核苷(酸)类似物作为抗HBV感染的主要药物,在抑制病毒方面取得了不错的成果。但随着用药时间延长,HBV都会在不同程度上表现出耐药,严重制约后续药物的选择及其疗效,那... 详细信息

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)一直以来就威胁着全人类的健康,核苷(酸)类似物作为抗HBV感染的主要药物,在抑制病毒方面取得了不错的成果。但随着用药时间延长,HBV都会在不同程度上表现出耐药,严重制约后续药物的选择及其疗效,那么,早期监测耐药就显得至关重要。目前,多数HBV耐药突变检测技术限于实验研究,只有直接测序法,荧光定量PCR和线性探针分析法三种检测技术用于临床耐药分析。相对其他两种技术而言,基于反向杂交原理的线性探针分析法简便,快速,可以实现多位点检测,具有广阔的应用前景。拉米夫定,阿德福韦和恩替卡韦是最早应用于临床乙型肝炎治疗的药物,本研究就是利用反向杂交原理,建立一种同时检测HBV对这三种药物耐药的方法。为了优化反应条件,本研究还构建了HBV耐药标准株。随后,对已建立的反向杂交体系进行方法学评价和临床评估。目的:构建HBV耐药标准株,利用野生和耐药标准株建立一种特异、灵敏地检测HBV对三种核苷(酸)类似物耐药的方法,并对确立的检测体系进行评估以便了解其可行性。方法:1.以扩增得到的267bp的突变片段(rt169T, rt173L, rt180M, rt181T, rt184G, rt202I, rt204V, rt215S, rt236T, rt250V)为诱变引物,HBV野生标准株为模板,PCR获得HBV全序列耐药标准株。 2.利用HBV野生和耐药标准株对反向杂交体系进行一系列优化,并筛选三种药物相关的十个耐药位点的理想探针(I169T, V173L/G, L180M, A181T/V, T184G, S202I/G, M204V/I,Q215S,N236T,M250V/I/L)。 3.对建立的反向杂交体系进行方法学评价和临床评估。应用本方法分别检测HBV野生和耐药标准株,分析其检测特异性;将PCR产物以一定比例稀释,确定其对PCR产物量的检测下限;以一定比例混合野生和耐药标准株,分析本方法对野生或耐药突变的检测灵敏度。为进一步了解其临床可行性,应用本方法对10份未接受核苷(酸)类似物治疗和30曾接受核苷(酸)类似物治疗的乙型肝炎患者血清标本进行检测,其结果与直接测序法分析结果进行比较,分析其检测准确性以及对病毒载量的检测下限。结果:1.成功构建了HBV耐药标准株(rt169T, rt173L, rt180M, rt181T, rt184G, rt202I, rt204V, rt215S, rt236T, rt250V),经直接测序证实,其碱基序列与目的序列一致。 2.初步确立反向杂交体系,并筛选到较为理想的检测探针。应用此方法可以区分单碱基差异,从而检出三种药物十个位点相关的耐药突变。 3.方法学评价和临床评估的实验结果证实本方法可以灵敏,特异地检出HBV耐药突变。当PCR产物的量达到10ng/μl时,本方法有效检测杂交信号;当HBV野生或耐药突变株占到病毒群体的5%时,可以被检测。临床标本的检测结果与直接测序法分析结果一致,且病毒载量在10拷贝/ml以上时,可以有效检测。结论:本研究通过诱变引物替换野生标准株上对应序列,快速,准确地构建HBV耐药标准株,这种方法为构建其他耐药突变体提供了新思路。在第二部分中,本研究利用野生和耐药标准株优化反应体系,并建立了一种同时检测HBV对三种核苷类似物耐药的方法。为有效区分HBV野生和耐药株,放大两者之间的单碱基差异,本研究作了许多有益的尝试,其中,选用含有氯化四乙铵的杂交液,探针两端加同聚物修饰,引物标记三个地高辛都取得了不错的效果。最后,通过方法学评价和临床可行性的分析,证明建立的检测体系是特异,灵敏的,可用于HBV耐药突变的检测。

关键词：乙型肝炎病毒耐药反向杂交

反向杂交快速检测HBV基因型方法的建立及临床应用

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反向杂交快速检测HBV基因型方法的建立及临床应用

作者：赵丽重庆医科大学

学位级别：硕士

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后的临床转归和对抗病毒治疗的应答,随感染基因型的不同存在明显差异。中国大陆地区主要以B型和C型为主,其中北方以C型多见,南方以B型多见。另外在我国一些地区还存在少量的基因型A和D。目前检... 详细信息

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后的临床转归和对抗病毒治疗的应答,随感染基因型的不同存在明显差异。中国大陆地区主要以B型和C型为主,其中北方以C型多见,南方以B型多见。另外在我国一些地区还存在少量的基因型A和D。目前检测HBV基因型的方法较多,但大都耗时费力,价格昂贵。目的:建立一种简便快速准确检测HBV基因型的方法,利用该方法实现同时对HBV A 4种基因型的检测,探讨该方法用于临床检测HBV基因型的可行性。方法:1.针对A、B、C和D型设计扩增引物和型特异性探针。上游引物在5’端进行地高辛修饰,探针两端进行多聚物加尾。选择经测序确定为HBV B型、C型的各1例慢性乙型肝炎患者血清标本,提取病毒DNA,通过TA克隆获得B、C型的标准株质粒;根据NCBI收录的HBV A、D、E型序列,将其分型探针和引物区域由公司合成,克隆在pMD18-T质粒载体上,构建A、D、E型的标准质粒株。通过巢式PCR扩增获得用于杂交的目的片段。 2.设计一系列优化实验,对探针载体、探针浓度及修饰、探针在载体上的固定、杂交条件、洗脱条件、抗体浓度以及显色方式进行优化,筛选出最佳反应条件,能特异灵敏的检测HBV基因型。 3.利用构建好的A型质粒评价方法的特异性和灵敏性。将B、C型质粒PCR产物按不同比例混合后杂交,评价该方法检测混合感染的能力。用该方法检测70例临床样本的HBV基因型,同时对这批样本的PCR产物直接测序分型,比较两种方法的一致性。结果:1.成功构建了A 8种基因型的重组质粒株,选择序列保守区设计了扩增引物和针对A型的分型探针。 2.优化后最佳工艺反应条件为:选择带正电荷尼龙膜为探针载体;探针进行多聚dC加尾、浓度稀释成10μmol/L,采用紫外交联和高温烘烤的方式对探针固定;地高辛抗体稀释倍数1:10000;38℃杂交1h并在38℃用0.5×SSC/0.1%SDS严格洗脱15min;采用碱性磷酸酶催化NBT/BCIP的方式显色。 3.该方法特异性好,没有交叉反应。灵敏度可检测到拷贝数为103copy/ml或以上的样本,并可检测到含量为5%的混合型感染。对70例慢性乙型肝炎患者血清样品的HBV基因型检测,其中67例样本得以分型,另有3例样本因为PCR未能扩增出阳性条带,用本方法和测序法均未能对其进行分型。直接测序法与我们的方法检测结果基本一致,特异性达98.51%。重庆地区感染HBV主要以B型为主。结论:我们成功建立了一种快速简便检测HBV基因型的方法。操作简单,适合临床上大规模推广使用,根据需要可以继续设计其他型特异性探针,达到对8种基因型的检测,具有广泛的应用前景。

关键词：反向杂交 HBV 基因型临床样本

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一种敏感的反向杂交／酶促发光检测方法

中华医学遗传学杂志 1994年第5期11卷 300-301页

作者：纪立农孙继红王虹毛腾淑王申五北京医科大学人民医院内分泌科

一种敏感的反向杂交／酶促发光检测方法纪立农，孙继红，王虹，毛腾淑，王申五随着分子生物学的迅速发展，人们已能够用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）及序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＳＳＯＰＨ）方法对许多基因（如ＨＬＡ基因）的多态性进... 详细信息

一种敏感的反向杂交／酶促发光检测方法纪立农，孙继红，王虹，毛腾淑，王申五随着分子生物学的迅速发展，人们已能够用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）及序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＳＳＯＰＨ）方法对许多基因（如ＨＬＡ基因）的多态性进行分析。美国Ｐｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ／...

关键词：反向杂交酶促发光检测基因多态性

应用肽核酸反向杂交技术检测HBV阿德福韦耐药突变株

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重庆医科大学学报 2014年第7期39卷 943-946页

作者：单雪峰谢素兰黄爱龙胡源重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400016

目的:建立一种肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)反向杂交技术,用于检测乙肝病毒阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)常见耐药突变位点。方法:利用反向杂交技术,设计出特异性的PNA探针,与PCR扩增后带有生物素标记的样本进行杂交;通过对... 详细信息

目的:建立一种肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)反向杂交技术,用于检测乙肝病毒阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)常见耐药突变位点。方法:利用反向杂交技术,设计出特异性的PNA探针,与PCR扩增后带有生物素标记的样本进行杂交;通过对探针浓度,杂交温度和时间等条件的优化建立起最佳反应条件。应用该技术检测了临床ADV治疗慢性乙肝患者的72例血清样本,与测序法比较了其检测的准确性。结果:(1)通过共价结合能够将PNA探针固定在尼龙膜上,特异性检测ADV常见耐药突变位点。(2)与直接测序法相比,PNA反向杂交技术检测准确性为97.88%。结论:通过优化杂交反应,建立起快速、灵敏的检测乙肝病毒ADV常见耐药突变位点的PNA反向杂交技术。

关键词：肽核酸反向杂交乙型肝炎病毒阿德福韦酯

双重PCR反向杂交快速检测及鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

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检验医学 2004年第5期19卷 396-398页

作者：鲁卫平安琳第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所检验科重庆400042 总装重庆军代局门诊部重庆400042

目的　研究以非培养法为基础的快速检测和鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)的方法。方法　将金黄色葡萄球菌mecA基因特异性探针固定在尼龙膜上 ,双重聚合酶链反应 (PCR)同时扩增待检DNA片段 ,在扩增中用bio 11 dUTP标记扩增产物 ,... 详细信息

目的　研究以非培养法为基础的快速检测和鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)的方法。方法　将金黄色葡萄球菌mecA基因特异性探针固定在尼龙膜上 ,双重聚合酶链反应 (PCR)同时扩增待检DNA片段 ,在扩增中用bio 11 dUTP标记扩增产物 ,然后与探针膜杂交。结果　 5 0株金黄色葡萄球菌sa4 4 2特异性基因片段检测结果为 10 0 %阳性 ,mecA基因结果阳性占 72 %。结论　该方法灵敏度高、特异性强 ,适用于临床快速检测和鉴定MRSA。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测 MRSA mecA基因反向杂交阳性特异性 PCR) 尼龙膜 DNA片段