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反义核苷酸抑制人高迁移率族蛋白1表达对胰腺癌细胞的影响

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华中科技大学学报（医学版） 2004年第5期33卷 562-565页

作者：黄庆先孙念峰王国斌王春友华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科武汉430022

目的　构建高迁移率族蛋白 1(HMGB1)基因的反义真核表达载体 ,寻找胰腺癌基因治疗新途径。方法应用分子克隆技术构建HMGB1基因反义真核表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1,转染胰腺癌细胞株PANC 1,通过逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)、... 详细信息

目的　构建高迁移率族蛋白 1(HMGB1)基因的反义真核表达载体 ,寻找胰腺癌基因治疗新途径。方法应用分子克隆技术构建HMGB1基因反义真核表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1,转染胰腺癌细胞株PANC 1,通过逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)、免疫印迹法 (Westernblot)、噻唑蓝 (MTT)比色法检测转染 4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化。结果　成功构建 pcDNA3 1/antisense HMGB1反义真核表达载体。所获反义表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低 (P 反义 pcDNA3 1/antisense HMGB1的导入能有效抑制PANC 1增殖活性 (P 反义RNA技术阻断HMGB1基因的表达 ,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性。

关键词：反义核苷酸 HMGB1 高迁移率族蛋白1 pcDNA3 胰腺癌细胞真核表达载体转染基因体外增殖 RNA

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反义核苷酸靶向纳米缩合体研究

反义核苷酸靶向纳米缩合体研究

作者：宋旭郑州大学

学位级别：硕士

非病毒DNA递送系统(nonviral DNA delivery system)已经成为基因治疗的有力工具。良好的非病毒DNA递送系统应该能够有效地穿透细胞膜，并把DNA转运到靶细胞内部。非病毒DNA递送系统的详细转运机制目前还不太清楚，但它们都涉及到DNA缩合... 详细信息

非病毒DNA递送系统(nonviral DNA delivery system)已经成为基因治疗的有力工具。良好的非病毒DNA递送系统应该能够有效地穿透细胞膜，并把DNA转运到靶细胞内部。非病毒DNA递送系统的详细转运机制目前还不太清楚，但它们都涉及到DNA缩合(DNA condensation)过程——被递送的DNA都要经历一个塌陷缩合成紧密有序的，仅由一到几个DNA分子组成的纳米微粒的过程。研究表明DNA缩合能够提高DNA的物理化学稳定性;另外由于可以使DNA缩合体表面的zeta电位为正值，而细胞表面带负电荷，使得DNA缩合体(DNA condensates)的转染效率大大提高。本研究的目的是利用DNA缩合技术把反义核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotides，ASON)递送到肿瘤细胞内部。这种反义核苷酸能够与人端粒酶逆转录酶的mRNA(human telomerase reverse transcriptase mRNA，hTERT mRNA)互补，抑制人端粒酶逆转录酶的表达，从而在基因水平上达到抑制肿瘤的目的。本研究分为三部分。第一部分考察了聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)诱导的反义核苷酸缩合，研究了各因素对缩合体的影响。第二部分设计了一条含有16个赖氨酸和一个NGR功能基团的多肽，制备了反义核苷酸靶向纳米缩合体。此NGR功能基团含有的NGR基序是氨基肽酶配体，能够靶向新生血管内皮细胞。第三部分的细胞学初步研究证明反义核苷酸靶向纳米缩合体能够有效地转染肿瘤细胞。

关键词：反义核苷酸缩合体靶向性

反义核苷酸抑制GA表达对胃癌增殖能力影响的实验研究

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反义核苷酸抑制GA表达对胃癌增殖能力影响的实验研究

作者：刘孟刚第三军医大学

学位级别：硕士

目的：通过把转染了含谷氨酰胺酶基因C末端反义序列质粒的胃癌细胞接种于裸鼠，观察其成瘤能力及增殖能力的变化，检验反义核酸技术抑制谷氨酰胺酶表达对肿瘤生长的抑制作用，为肿瘤的基因治疗提供新的理论依据。方法：本课题前期... 详细信息

目的：通过把转染了含谷氨酰胺酶基因C末端反义序列质粒的胃癌细胞接种于裸鼠，观察其成瘤能力及增殖能力的变化，检验反义核酸技术抑制谷氨酰胺酶表达对肿瘤生长的抑制作用，为肿瘤的基因治疗提供新的理论依据。方法：本课题前期阶段已将含谷氨酰胺酶基因C末端反义序列的质粒转染入胃癌细胞并命名为SGC-7901。先把SGC-7901细胞和空白对照组细胞SGC-7901进行体外培养，再把两种胃癌细胞接种于6周龄BALB／C裸鼠皮下，建立胃癌的裸鼠动物模型，观察裸鼠成瘤情况。采用MTT法检测两种胃癌细胞在体外生长能力的差异，免疫组织化学方法(S-P法)检测肿瘤组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达，TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡，采用RT-PCR技术检测肿瘤组织中谷氨酰胺酶mRNA的含量。结果： 1．两组细胞的生长曲线显示SGC-7901细胞增生速度明显低于对照组。 2．以相同的细胞浓度接种于裸鼠，实验组成瘤时间明显晚于对照组，成瘤后肿瘤生长速度实验组也明显慢于对照组，实验组肿瘤平均重量明显低于对照组。 3．实验组肿瘤组织的细胞增殖指数明显低于对照组，而细胞凋亡指数明显高于对照组。 4．肿瘤组织中谷氨酰胺酶mRNA的含量实验组明显低于对照组。结论：通过谷氨酰胺酶基因C末端反义序列封闭谷氨酰胺酶的基因，抑制了谷氨酰胺酶的表达，降低了胃癌细胞内谷氨酰胺酶的活性，阻断了胃癌对谷氨酰胺的利用，从而抑制了肿瘤的增殖，促进了肿瘤细胞的凋亡。反义核苷酸技术抑制谷氨酰胺酶表达的方法是治疗肿瘤的一个新途径。

关键词：谷氨酰胺谷氨酰胺酶反义核苷酸胃癌肿瘤增殖细胞核抗原细胞凋亡裸鼠 RT-PCR

白细胞介素-6反义核苷酸抑制胆管癌细胞增殖和诱导其凋亡的实验研究

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武汉大学学报（医学版） 2011年第1期32卷 8-11,78,F0002页

作者：刘卓文刘凌孙权武汉大学中南医院普外科湖北武汉430071

目的:研究白细胞介素-6(IL-6)反义核苷酸(ASODN)对人肝内胆管癌HCCC-9810细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过脂质体LipofectamineTM2000介导IL-6ASODN转染人肝内胆管癌HCCC-9810细胞,细胞克隆率形成实验和MTT实验检测IL-6ASODN对胆管癌细... 详细信息

目的:研究白细胞介素-6(IL-6)反义核苷酸(ASODN)对人肝内胆管癌HCCC-9810细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过脂质体LipofectamineTM2000介导IL-6ASODN转染人肝内胆管癌HCCC-9810细胞,细胞克隆率形成实验和MTT实验检测IL-6ASODN对胆管癌细胞增殖的影响,流式细胞仪检测IL-6ASODN对胆管癌细胞凋亡的影响,RT-PCR检测转染后IL-6mRNA表达水平的变化。结果:转染后,细胞克隆形成率反义组为(4.58±0.35)%,反义组显著低于各对照组(P反义组的细胞增殖抑制率为67.2%,反义组细胞增殖抑制率显著高于对照组(P反义组细胞的凋亡率为(10.25±0.13)%,显著高于对照组(P反义组胆管癌细胞IL-6mRNA表达水平较空白组下降60.52%,能显著抑制IL-6mRNA的表达,较其余各组差异有显著性(P反义寡核苷酸可以抑制胆管癌HCCC-9810细胞的增殖,并可以诱导其凋亡。

关键词：白细胞介素-6 反义核苷酸胆管肿瘤增殖凋亡

γ－32P标记反义核苷酸对HBV基因表达的封闭效应

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解放军医学杂志 1995年第3期20卷 186-189页

作者：冯雪梅周永兴姚志强白雪帆张长法长春解放军第208医院

人工构建特异性互补于ＨＢＶ基因ｍＲＮＡＳＰⅡ增强子区的１５－聚反义硫代脱氧核苷酸（１５Ｓ－ａｓＯＮ）并用ｌ－３２Ｐ进行末端标记，以２μＬｍｏ１／Ｌ剂量作用于ＨＢＶ基因转染的ＨｅｐＧ２细胞（２．２．１５细胞），培养２４... 详细信息

人工构建特异性互补于ＨＢＶ基因ｍＲＮＡＳＰⅡ增强子区的１５－聚反义硫代脱氧核苷酸（１５Ｓ－ａｓＯＮ）并用ｌ－３２Ｐ进行末端标记，以２μＬｍｏ１／Ｌ剂量作用于ＨＢＶ基因转染的ＨｅｐＧ２细胞（２．２．１５细胞），培养２４ｈ及４８ｈ后检测掺入２．２．１５细胞的１５－Ｓ－ａｓＯＮ分别为６９．４ｎｍｏ１／Ｌ和７５．８ｎｍｏ１／Ｌ；对ＨＢ３ｓＡｇ的抑制率分别为５０％和７０％；斑点杂交检测ＨＢＶＤＮＡ，结果表明实验组与对照组无显著性差异，提示本实验所选用的反义核苷酸对ＨＢＶ基因的封闭环节可能发生在翻译水平。实验组与对照组的细胞形态及细胞计数结果表明：我们设计的反义核酸只特异性抑制ＨＢＶ基因表达，而对宿主细胞无明显毒害作用。

关键词：乙型肝炎病毒基因表达基因治疗反义核苷酸

miR-93反义核苷酸对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响

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重庆医科大学学报 2014年第3期39卷 396-400页

作者：骆萍钟晓鸣谢春伟南昌市第三医院乳腺外科南昌330009 江西省肿瘤医院乳腺外科南昌330029

目的:研究miR-93在乳腺癌组织中的表达情况,并分析miR-93反义核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:运用荧光定量PCR定量检测120例乳腺癌组织及对应癌旁组织中miR-93的表达;通过miR-93ASO降低乳腺... 详细信息

目的:研究miR-93在乳腺癌组织中的表达情况,并分析miR-93反义核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:运用荧光定量PCR定量检测120例乳腺癌组织及对应癌旁组织中miR-93的表达;通过miR-93ASO降低乳腺癌细胞中miR-93的表达,利用MTT、细胞克隆形成实验、流式细胞仪观察miR-93 ASO对乳腺癌细胞产生的生物学效应。实验分为3组:空白对照组,无义干扰组和miR-93 ASO组。结果:在120例乳腺癌病例中,63.33%(76/120)的乳腺癌组织miR-93表达明显高于对应癌旁组织(P<0.05);miR-93 ASO可以显著降低miR-93的表达(P<0.05);MTT实验结果显示乳腺癌细胞转染miR-93 ASO 24、48 h和96 h后的细胞存活数量均明显低于空白对照组和无义干扰组(P<0.05);克隆形成实验结果显示miR-93 ASO组克隆形成率比空白对照组和无义干扰组显著降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示转染miR-93ASO组较2个对照组细胞凋亡指数明显增加(P<0.05);另外,降低miR-93的表达后发现Bcl2的mRNA和蛋白均明显下降(P<0.05)。结论:miR-93在乳腺癌组织中表达上调,降低miR-93的表达可有效抑制乳腺癌细胞生长、促进细胞凋亡。miR-93有可能成为乳腺癌基因表达调控的新靶点。

关键词： miR-93 反义核苷酸乳腺癌细胞增殖细胞凋亡

转染血管紧张素Ⅱ受体反义核苷酸对心肌细胞生长的作用

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第三军医大学学报 2001年第4期23卷 401-403页

作者：杨永健祝善俊祝之明胡厚祥丁钢第三军医大学附属新桥医院心血管内科重庆400037 第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所高血压中心重庆400042

目的　评价转染AT1反义核苷酸 (AT1A)对心肌细胞血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )受体亚型mRNA表达 ,及蛋白质和核酸合成的作用。方法　RT PCR克隆AT1cDNA序列 (476bp) ,将克隆的AT1cDNA反向插入PcDNA3 .1(5 .4kb) ,构建一完整的含AT1A的质粒 (PAT... 详细信息

目的　评价转染AT1反义核苷酸 (AT1A)对心肌细胞血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )受体亚型mRNA表达 ,及蛋白质和核酸合成的作用。方法　RT PCR克隆AT1cDNA序列 (476bp) ,将克隆的AT1cDNA反向插入PcDNA3 .1(5 .4kb) ,构建一完整的含AT1A的质粒 (PAT1A) ,并转染入培养的心肌细胞 ,RT PCR和免疫印迹鉴定其转染后AT1mRNA和蛋白表达。比较AngⅡ 10 -7mol/L剌激 2 4h后的转染及非转染的心肌细胞AT1及AT2 mRNA表达 (RT PCR)、蛋白质和核酸合成 (3 H Leu及3 H TdR掺入量 )。结果　成功构建PAT1A。转染心肌细胞AT1mRNA和蛋白表达量显著减少 ,与正常对照心肌细胞相比差异有非常显著性 (P 0 .0 5 )。结论　经AT1A封闭后 ,心肌细胞AT1mRNA表达显著抑制 ,同时AT2 mRNA上调。

关键词：血管紧张素Ⅱ 受体反义核苷酸心肌细胞细胞生长基因转染

人类端粒酶逆转录酶基因反义核苷酸对白血病细胞端粒酶活性的影响

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中国实验血液学杂志 2002年第6期10卷 523-526页

作者：何冬梅张洹暨南大学医学院血液病研究所广州510632

为了探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因反义寡核苷酸 (ASODN)对原代培养的急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病 (CML)细胞端粒酶活性的影响 ,采用间接免疫荧光标记方法 ,通过流式细胞术检测hTERT基因ASODN作用于AML和CML细胞后hTERT... 详细信息

为了探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因反义寡核苷酸 (ASODN)对原代培养的急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病 (CML)细胞端粒酶活性的影响 ,采用间接免疫荧光标记方法 ,通过流式细胞术检测hTERT基因ASODN作用于AML和CML细胞后hTERT蛋白表达含量的变化 ,采用端粒酶聚合酶链反应酶联免疫测定 (PCR ELISA)法检测白血病细胞端粒酶活性的改变。结果显示 :hTERTASODN作用于AML和CML细胞2 4 ,48和 72小时后 ,hTERT蛋白表达水平不断降低 ;同时 ,AML和CML细胞端粒酶活性均逐渐受到抑制。结论 :hTERT基因ASODN可以通过特异性地抑制AML和CML细胞hTERT蛋白的表达。

关键词：人类端粒酶逆转录酶基因反义核苷酸白血病细胞端粒酶活性

白蛋白纳米载体介导的端粒酶反义核苷酸治疗肝脏肿瘤

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白蛋白纳米载体介导的端粒酶反义核苷酸治疗肝脏肿瘤

作者：李沐纯中南大学

学位级别：硕士

目的:利用纳米载体增强端粒酶反义寡核苷酸对肝脏肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:进行白蛋白纳米载体制备工艺的研究,考察固化温度、固化时间、搅拌速度对纳米粒制备的影响;实验设6组:(1)空白对照组,(2)纯纳米粒组,(3)游离正义寡核苷酸... 详细信息

目的:利用纳米载体增强端粒酶反义寡核苷酸对肝脏肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:进行白蛋白纳米载体制备工艺的研究,考察固化温度、固化时间、搅拌速度对纳米粒制备的影响;实验设6组:(1)空白对照组,(2)纯纳米粒组,(3)游离正义寡核苷酸组,(4)游离反义寡核苷酸组,(5)正义寡核苷酸-纳米粒组,(6)反义寡核苷酸-纳米粒组。用TRAP-ELASA法检测端粒酶反义寡核苷酸对肿瘤细胞端粒酶活性的影响,以MTT法测定端粒酶反义寡核苷酸对肝脏肿瘤细胞(HepG2)生长的抑制作用。每组10只荷瘤裸鼠,给药15d后,分离肿瘤组织称重,测定端粒酶反义寡核苷酸对体内肿瘤组织生长的抑制。结果:白蛋白纳米载体能显著增强端粒酶反义寡核苷酸对端粒酶活性和肿瘤细胞生长的抑制作用。结论:纳米粒可作为反义技术治疗的有效载体。

关键词：白蛋白纳米粒反义核苷酸端粒酶