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化学研究与应用 2023年第5期35卷 1124-1131页

作者：文艳清龙倩张友玉李海涛湖南安全技术职业学院湖南长沙410151 湖南师范大学化学化工学院湖南长沙410181

本文介绍了一种基于无标记双重信号放大的简单、超灵敏的配体传感器,采用电化学阻抗法检测凝血酶,用氧化还原探针[Fe(CN)_(6)]^(3-/4-)分析表征电极表面电荷传递阻抗的变化(ΔR et),凝血酶与其适配体特异性结合,形成的“三明治”夹心结... 详细信息

本文介绍了一种基于无标记双重信号放大的简单、超灵敏的配体传感器,采用电化学阻抗法检测凝血酶,用氧化还原探针[Fe(CN)_(6)]^(3-/4-)分析表征电极表面电荷传递阻抗的变化(ΔR et),凝血酶与其适配体特异性结合,形成的“三明治”夹心结构,以及双链DNA刚性结构的增敏作用,可实现双重放大信号的作用,提高目标物的测定灵敏度。结果显示,线性范围良好,为0.02~10 nmol·L^(-1),检出限低,达0.22 pmol·L^(-1),方法简单、灵敏、特异性高,能用于人血清样品中凝血酶的检测。

关键词：适配体凝血酶双重信号放大电化学阻抗谱(EIS)

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基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光猝灭性质的核酸检测方法

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分析化学 2017年第3期45卷 303-308页

作者：刘宇飞薛金涛闫慧娟杨丽娟刘巍孙祥德新乡医学院药学院

将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与Mo S纳米片的荧光猝灭性质结合,构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法。首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸(HP1和HP2)。由于两条探针核酸具有3’粘性末端,使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解,... 详细信息

将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与Mo S纳米片的荧光猝灭性质结合,构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法。首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸(HP1和HP2)。由于两条探针核酸具有3’粘性末端,使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解,因而被吸附于Mo S纳米片而猝灭其荧光。当目标DNA存在时,会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应,并将探针核酸降解成大量的不能吸附于Mo S纳米片表面的荧光碎片。在优化条件下,目标DNA浓度在0.5~6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系,检出限为0.28 pmol/L。与单重信号放大技术相比,本方法极大改善了分析灵敏度和检出限,且具有良好的单碱基错配区分能力。

关键词： DNA传感器 Mo S2纳米片核酸外切酶Ⅲ 双重信号放大荧光猝灭

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基于点击化学连接触发链置换介导发夹堆叠的循环microRNAs生物传感检测技术的构建

基于点击化学连接触发链置换介导发夹堆叠的循环microRNAs生物传...

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作者：赵爽中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景与目的循环microRNA是一类长度很短的内源性非编码RNA家族,由活细胞分泌并在各种体液(如血液、尿液和脑脊液)中保持稳定。循环microRNA的异常表达与肿瘤、心血管疾病等疾病密切相关。与一些传统的生物标志物相比,microRNA异常... 详细信息

研究背景与目的循环microRNA是一类长度很短的内源性非编码RNA家族,由活细胞分泌并在各种体液(如血液、尿液和脑脊液)中保持稳定。循环microRNA的异常表达与肿瘤、心血管疾病等疾病密切相关。与一些传统的生物标志物相比,microRNA异常表达在肿瘤患者中可能出现的更早。因此,循环microRNA被认为是可能在前瞻性监测和临床筛检中有重要价值的生物标志物。由于体液中microRNA丰度低且长度短,因此检测时多使用酶催化的核酸扩增策略,如逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、等温指数扩增(Isothermal exponential amplification)等。尽管这些策略灵敏且有效,但都需要一种或多种酶的参与,这增加了检测程序的复杂性及检测成本。此外,酶活性容易受到环境因素的影响,这提高了对检测环境的要求。相比之下,一些无酶方法更具成本效益、更简单和易于实施,因此具有很大研究价值。近年来,将无铜点击化学反应连接经过修饰的寡核苷酸探针作为信号放大策略引起了广泛的关注。与DNA或RNA连接酶相比,它依赖于叠氮化物(N)和二苯并环辛炔(DBCO)之间的化学反应,表现出更好的相容性和更高的连接效率。在短链模板存在的情况下,点击化学反应可以在没有金属催化剂的情况下自发顺利进行,热循环的加入使得microRNA循环利用,实现第一次信号放大。为了实现点击化学连接反应的后续信号输出,磁珠分离,金纳米粒子聚集以及对连接产物进行加尾等一些策略已被研究,但相比之下,直接在反应后体系中加入三种发夹探针,构建可由点击化学连接产物触发的链置换介导的发夹堆叠DNA环路可以以一种更为简便和高性价比的方式实现信号输出并对信号进行二次放大,从而实现对microRNA进行准确的定量检测。本研究旨在基于这一设想构建一种基于点击化学连接触发链置换介导发夹堆叠的双循环信号放大生物传感平台,并将其用于循环microRNA的检测。研究方法1、设计用于循环点击化学连接反应的探针序列和用于发夹堆叠组装反应的DNA发夹序列,使用***对相应序列和产物结构进行分析。2、使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE)、原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)、荧光检测验证及背景信号来源分析对检测策略可行性进行分析。3、双循环信号放大检测的相关试验参数优化(1)循环点击化学反应的实验参数优化:依次优化点击化学探针的类型;点击化学探针的浓度;反应体系中Tween-20的浓度;点击化学连接热循环次数。(2)发夹堆叠组装的实验参数优化:依次优化DNA发夹toehold的有效碱基个数;DNA发夹的浓度;发夹堆叠组装反应时长。4、评估双循环信号放大策略的检测性能(1)确定双循环信号放大检测策略的检测线性范围和检测限。与单一发夹堆叠组装检测microRNA的检测灵敏度进行比较。(2)评估双循环信号放大检测策略的特异度,包括区分其他microRNA及碱基突变的能力,以及在复杂RNA混合物中定量低浓度靶标的能力。5、通过加标回收试验验证双循环信号放大检测策略在复杂生物样本(稀释血浆)中的检测能力。研究结果通过PAGE、有无靶标时荧光信号的差异、背景信号分析成功验证了双循环信号放大检测microRNA策略的可行性,并用AFM对最终的“Y”型DNA三聚体结构产物进行了成功表征。确定了传感平台的最优实验参数:使用DNA-N探针和DNA-DBCO探针作为点击化学探针;点击化学探针浓度为200 n M;点击化学反应体系中Tween-20浓度为0.5%;热循环次数为70次;发夹探针toehold有效碱基数为5个;发夹探针浓度为700 n M,发夹堆叠反应时间为1.5 h。双循环信号放大策略的检测线性范围为20 p M-2 n M,检测下限为8.63 p M。相比于单一发夹堆叠组装检测microRNA检测下限低2个数量级。构建的检测平台具有识别碱基突变和在复杂microRNA混合物中准确定量靶标microRNA的能力。加标回收试验中,回收率为92.45%-108.92%,相对标准偏差为:2.14%-5.30%。说明其能在复杂血浆生物样本中发挥理想检测效果。结论本研究成功构建了一种基于点击化学连接触发链置换介导发夹堆叠的生物传感平台用于循环microRNA的灵敏、特异、准确检测。具有无需酶参与,无需铜催化,操作简单可控等优势。为无酶化学反应和无酶DNA环路在生物传感中的应用提供了新的思路。

关键词：循环microRNA 无酶检测双重信号放大无铜点击化学连接链置换发夹堆叠组装

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三元纳米复合材料用于光电化学DNA甲基化生物传感分析

三元纳米复合材料用于光电化学DNA甲基化生物传感分析

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作者：罗靖西南大学

学位级别：硕士

DNA甲基化作为重要的表观遗传学修饰标志物之一,在哺乳动物的成长发育过程中起着至关重要的作用。DNA甲基化水平的异常表达,特别是位于抑癌基因启动子区域所发生的异常变化,通常会阻碍相关蛋白结合到与其对应的转录因子上,抑制基因表达... 详细信息

DNA甲基化作为重要的表观遗传学修饰标志物之一,在哺乳动物的成长发育过程中起着至关重要的作用。DNA甲基化水平的异常表达,特别是位于抑癌基因启动子区域所发生的异常变化,通常会阻碍相关蛋白结合到与其对应的转录因子上,抑制基因表达并导致基因沉默,进而引起各种癌症的发生,例如白血病、乳腺癌、肺癌和肝癌。目前,大量的科学研究已经证实DNA甲基化的过程是通过DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,DNA MTase)的催化作用完成的。在酶和以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体的共同帮助下,DNA胞嘧啶的第五个碳原子上能添加一个甲基,形成5-甲基胞嘧啶(5-methyl-cytosine,5-mC)。同时,还有研究发现DNA甲基转移酶活性的改变通常发生在基因的甲基化异常表达之前,更远远早于甲基化相关疾病的临床诊断。因此,采用检测DNA MTase活性的方法来判断DNA甲基化水平,实现对DNA甲基化紊乱疾病的早期临床诊断与预警,已经成为了表观遗传领域与实验诊断领域交叉研究的一个前沿热点。光电化学(Photoelectrochemical,PEC)是以传统的电化学检测作为模型,新增以光源作为信号激发来源的一门新技术。它既保留了电化学方法的固有优势,如操作简便,信号响应快,稳定性好;又增加了光学独一无二的新优势,例如所产生的背景信号低对实验干扰小,检测灵敏度高。基于上述优点,以PEC方法为技术依托的PEC生物传感器快速成为了最热门的检测手段之一。它以光学和电学信号转换作为基础,根据光电活性材料发生电荷转移产生光电流信号响应的变化来实现对待测物的灵敏检测。光电活性材料作为其中重要的组成部分之一,对光电流信号的响应起着关键性作用。研究表明纳米复合材料通过两种或多种不同禁带宽度的光电活性材料的混合或掺杂,既扩展了它的光吸收范围,又增强了它的导电性和光伏特性,从而导致所产生的光电流信号响应远远高于单一材料产生的信号响应。鉴于此,本研究以PEC生物传感器为模型,选取两种不同的DNA MTase作为靶标,合成不同的三元纳米复合材料作为光电活性材料,采用不同的信号响应策略实现对它们活性的检测,主要研究内容及结果如下:1.采用RGO-CdS:Mn NPs和CdTe@DNA网状结构的双重信号放大策略用于*** MTase活性检测本研究中利用RGO-CdS:Mn NPs和CdTe@DNA网状结构的双重信号放大系统构建PEC生物传感器来检测*** I MTase的活性。首先,RGO-CdS:Mn NPs附着在金电极表面作为基底材料,由于还原氧化石墨烯(RGO)较大的比表面积能负载更多的CdS:Mn NPs,可以产生一定的光电流信号响应。接着,依次在修饰电极上连接探针DNAS1,BSA和具有DNA甲基化识别序列的靶标DNA S2。在经过*** I MTase甲基化和HpaII酶消化过程之后,甲基化的双链DNA可以保留下来进一步与CdTe@DNA网状结构杂交,从而产生增强的光电流信号响应。因此,在双重信号放大系统的作用下,所产生的光电流信号响应与*** I MTase浓度的对数表现出明显的线性关系,线性范围从0.01 U/m L至80 U/mL,最低检测极限为0.0071 U/mL。该方法能够灵敏地检测出*** I MTase的活性,并为DNA甲基化相关疾病的临床诊断提供新的思路和方法。2.采用g-CN-CdS:Mn NPs和SiO@CdTe的共敏化扩增策略用于Dam MTase活性检测本研究中利用g-CN-CdS:Mn NPs和SiO@CdTe的共敏化扩增策略构建了一种超灵敏PEC生物传感器用于Dam MTase活性的检测。首先,g-CN-CdS:Mn NPs作为基底材料涂覆在玻碳电极表面,由于其扩大了光的吸收能力并加速光生电子的传输,可以提供强烈的基底光电流信号响应。接着,探针DNA S1,MCH和探针DNA S2依次连接于修饰电极表面。同时,茎环结构的靶标DNA探针在电极外经过Dam MTase和Dpn I酶处理之后,能够将其甲基化并对其进行剪切。释放的靶标DNA片段能与探针DNA链杂交并后续进行EXO III的消化作用。最后,SiO@CdTe-DNA连接在电极表面,通过共敏化作用产生极强的光电流信号响应。在最优实验条件下,所增加的光电流信号响应与Dam MTase浓度的对数表现出良好的正相关性,线性范围从0.01 U/mL至120 U/mL,最低检测极限为0.0068 U/mL。该方法能够完成对Dam MTase活性的超灵敏检测,并在临床诊断DNA甲基化紊乱疾病拥有广阔的前景。

关键词： PEC生物传感器 DNA MTase活性三元纳米复合材料双重信号放大共敏化扩增

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仿生光电纳米传感界面的构建与应用

仿生光电纳米传感界面的构建与应用

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作者：赵明安徽理工大学

学位级别：硕士

光电化学(PEC)过程是指在电化学的基础上以光作为信号激发源,以电流信号作为检测信号,来实现能量转换、检测分析和能量利用的技术手段。PEC传感体系的灵敏度因激发源和检测信号的形式不同得到提高。由于PEC生物分析方法诸如灵敏度高、... 详细信息

光电化学(PEC)过程是指在电化学的基础上以光作为信号激发源,以电流信号作为检测信号,来实现能量转换、检测分析和能量利用的技术手段。PEC传感体系的灵敏度因激发源和检测信号的形式不同得到提高。由于PEC生物分析方法诸如灵敏度高、选择性好、检测成本低等优点,使得它被广泛应用于临床分析、环境污染物监测等领域中。为了提高传感器的灵敏度,多种方法已经被开发出来,例如能量转移共振,敏化或共敏化结构等。在这些背景下,本论文致力于研发新型高灵敏的光电化学检测体系,实现对目标物的痕量检测。本论文将纳米材料、光电化学分析方法、适配体探针有机结合起来,围绕PEC生物分析的应用开展研究,主要内容如下：1、基于激子能量转移和敏化作用构建的双重信号放大型光电化学传感器实现对Hg2+的高灵敏和选择性检测基于CdS量子点(QDs)和Au纳米颗粒(NPs)之间的激子能量转移(EET)与信号放大元素罗丹明123(Rh123)开发出具有高选择性和灵敏度Hg2+检测的PEC生物传感器。通过将CdS QDs沉积在ITO/TiO2电极上得到TiO2/CdS杂化结构,并将其作为基底用来固定探针DNA (pDNA)。之后,Rh123被引入到pDNA的末端来实现对该PEC生物传感器的敏化。标记了Au NPs的目标DNA (Au-tDNA)与pDNA杂交配对,CdS QDs与Au NPs之间发生的EET会导致光电流的显著降低。该生物传感器对Hg2+的检测是基于与Hg2+孵育后pDNA的构型变化来实现的。当没有Hg2+存在时,由于双链DNA的刚性,使得Rh123远离电极表面,导致其敏化作用较弱;而且因为CdS QDs和AuNPs之间的激子能量转移,使得光电流有显著的降低。但是,当Hg2+时,DNA的双螺旋结构被破坏,使得CdS QDs和AuNPs之间的能量转移被破坏,光电流强度恢复;而且pDNA的构型变化会使得Rh123靠近电极表面,导致敏化作用的增强,从而使得光电流强度有明显的增加。该PEC生物传感器的灵敏度因双重信号放大结构而得到提高,对Hg2+检测的线性范围为10 fM到200 nM,检测限为3.3fM。这种方法也为其他重金属离子的超低浓度检测提供了一种有效的思路。2、基于MoS2-CdS:Mn纳米复合物和敏化效应构建了高灵敏Pb2+检测的光电化学适配体传感体系基于MoS2-CdS:Mn纳米复合物(NCs)和敏化结构构建了一个用于Pb2+灵敏检测的PEC传感体系。MoS2-CdS:Mn NCs是在超声得到的MoS2纳米片水溶液中制备的。首先,MoS2-CdS:Mn NCs被滴加在电极上,待其成膜干燥后将其作为PEC传感器的基底材料。之后,适配体(pDNA)通过EDC催化的耦合反应固定在pDNA末端。然后,目标DNA和作为敏化物质的CdTe-NH2 QDs被一步步修饰至电极上。该PEC生物传感器对pb2+的检测是基于与pb2+孵育后的pDNA构型变化而得到的。在没有pb2+存在时,作为敏化剂的CdTe-NH2 QDs由于双链的刚性远离电极表面,导致传感体系的光电流较低。而在Pb2+存在时,双链因pDNA与Pb2+亲和性弯曲形成G四联体,导致敏化剂CdTe-NH2 QDs靠近电极表面,敏化作用得到增强,体系光电流增加。该PEC生物传感器的灵敏度由于MoS2-CdS:Mn NCs和CdTe-NH2 QDs的敏化作用而增强,对Pb2+检测的线性范围可达50fM-100nM,检测限可达16.7fM。

关键词：光电化学 TiO2/CdS杂化结构激子能量转移敏化作用双重信号放大 Hg2+检测 MoS2-CdS:Mn纳米复合物适配体传感 CdTe-NH2量子点 Pb2+检测

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