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利用Gal4/VP16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性

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现代生物医学进展 2006年第3期6卷 1-4页

作者：刘忠华阮燕查芹芹张岱北京大学精神卫生研究所北京100083

目的:确立基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白活性的方法。方法:将插入上游激活序列(UAS)和萤火虫荧光素酶报告基因的质粒MH100,嵌合酵母活性转录因子(Gal4)、单纯疱疹病毒蛋白(VP16)和γ-分泌... 详细信息

目的:确立基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白活性的方法。方法:将插入上游激活序列(UAS)和萤火虫荧光素酶报告基因的质粒MH100,嵌合酵母活性转录因子(Gal4)、单纯疱疹病毒蛋白(VP16)和γ-分泌酶切割位点的质粒C99-GVP,以及海肾荧光素酶质粒pRL-CMV,用脂质体转染法转入稳定表达淀粉样前体蛋白C末端的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),用免疫沉淀Westernblot分析法检测β-淀粉样蛋白(Aβ)的生成,利用Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统测定荧光素酶报告基因的表达。结果:免疫沉淀Westernblot分析表明A(的生成在γ-分泌酶激活剂神经节苷脂GM1作用下升高并呈剂量依赖性,同时双荧光素酶法检测γ-分泌酶活性也同步升高。在γ-分泌酶抑制剂作用下Aβ的产生呈剂量依赖性的减少,同时γ-分泌酶活性也同步降低。结论:基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性的方法有效可靠,是一种敏感、定量的检测方法。

关键词： Gal4/vp16-UAS 双荧光素酶 γ-分泌酶阿尔茨海默症

低氧胁迫下鲢miR-17a-5p及其靶基因分析

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水产学报 2023年第1期47卷 138-151页

作者：李晓晖冯翠王巧欣邹桂伟梁宏伟中国水产科学研究院长江水产研究所华中农业大学湖北洪山实验室

为了探究miR-17a-5p在鲢低氧胁迫下的功能，在前期鲢small RNA测序的基础上对鲢miR-17a-5p进行靶基因预测及功能富集分析，通过双荧光素酶活性验证其与HIF-1α的靶向关系，并检测低氧胁迫下miR-17a-5p和其靶基因在鲢肝脏、脑、心脏和鳃... 详细信息

为了探究miR-17a-5p在鲢低氧胁迫下的功能，在前期鲢small RNA测序的基础上对鲢miR-17a-5p进行靶基因预测及功能富集分析，通过双荧光素酶活性验证其与HIF-1α的靶向关系，并检测低氧胁迫下miR-17a-5p和其靶基因在鲢肝脏、脑、心脏和鳃四个组织中的动态表达特征。结果显示，鲢miR-17a-5p在不同物种间高度保守，预测出381个miR-17a-5p的潜在靶基因显著富集在硫代谢、mTOR信号通路以及萜类骨架的生物合成3个KEGG信号通路上。miR-17a-5p可与HIF-1α mRNA的3′UTR结合，并降低HIF-1α mRNA水平，低氧胁迫下miR-17a-5p的表达呈下降趋势，而HIF-1α表达则呈上升趋势；3个显著富集KEGG通路中的11个miR-17a-5p潜在靶基因在低氧胁迫过程中的不同组织中的表达，尤其是肝脏中的表达，除SGK1外，均呈显著上升趋势。研究表明，低氧胁迫下鲢各组织中miR-17a-5p的表达下调减弱了其对靶基因的抑制作用，进而导致HIF-1α、ddit4和Lrp5等响应低氧胁迫的基因表达上调。本研究为低氧胁迫下鲢miRNA的表达与调控机制提供新见解，也为培育耐低氧的鲢新品系(种)提供了参考。

关键词：鲢 miR-17a-5p 低氧双荧光素酶靶基因信号通路

黄芩苷调节let-7i-3p/PI3K/Akt/NF-κB信号轴减轻类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞NLRP3炎性小体活化

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中国药理学通报 2023年第12期39卷 2313-2319页

作者：张炜王莉杨雨欣马锐王丽黄菱万巧凤宁夏医科大学基础医学院病原生物学与医学免疫学系宁夏银川750004 宁夏医科大学总医院风湿科宁夏银川750003 宁夏医科大学临床医学院宁夏银川750004

目的研究黄芩苷减轻类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(human fibroblast like synoviocytes of rheumatoid arthritis,HFLS-RA)NLRP3炎性小体活化的作用及机制。方法为证实黄芩苷减轻HFLS-RA中NLRP3炎性小体活化,采用免疫荧光观察黄芩苷处... 详细信息

目的研究黄芩苷减轻类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(human fibroblast like synoviocytes of rheumatoid arthritis,HFLS-RA)NLRP3炎性小体活化的作用及机制。方法为证实黄芩苷减轻HFLS-RA中NLRP3炎性小体活化,采用免疫荧光观察黄芩苷处理前后NLRP3的表达;Western blot检测黄芩苷处理48 h后,p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白的表达;ELISA检测细胞上清中IL-1及IL-18的含量。为探究黄芩苷减轻NLRP3炎性小体活化的机制,采用双荧光素酶及Western blot验证let-7i-3p与PIK3CA的对应关系;RT-qPCR检测黄芩苷干预前后let-7i-3p及PI3K的表达;采用let-7i-3p干扰,验证黄芩苷是否减轻了增强的NLRP3炎性小体的活化。结果50、100 mg·L^(-1)黄芩苷明显减轻了NLRP3炎性小体的活化,抑制p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白的表达,抑制IL-1、IL-18的分泌。let-7i-3p与PIK3CA存在靶向对应关系,黄芩苷上调了let-7i-3p的表达、下调了PIK3CA的表达;黄芩苷减轻了因let-7i-3p干扰而增强的NLRP3炎性小体的活化。结论黄芩苷经上调let-7i-3p表达、抑制PI3K/Akt/NF-κB信号转导,从而减轻NLRP3炎性小体的活化。

关键词：黄芩苷类风湿关节炎类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞 NLRP3炎性小体 miRNA 双荧光素酶

乳腺癌筛选差异表达的miRNAs-mRNA及其与靶基因的关系

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临床与实验病理学杂志 2022年第5期38卷 532-537页

作者：刘海英陈峰王梅姚嘉海南省人民医院乳腺外科海口570000 海南省人民医院综合介入科海口570000

目的筛选乳腺癌差异表达的miRNAs-mRNA,探讨差异miRNAs的表达及与靶基因的关系。方法利用肿瘤基因组图谱(TCGA)筛选乳腺癌中差异表达的4种miRNAs;利用qRT-PCR验证4种miRNAs在多种细胞株中的表达;结合GO和KEGG确定4种miRNAs的靶基因。利... 详细信息

目的筛选乳腺癌差异表达的miRNAs-mRNA,探讨差异miRNAs的表达及与靶基因的关系。方法利用肿瘤基因组图谱(TCGA)筛选乳腺癌中差异表达的4种miRNAs;利用qRT-PCR验证4种miRNAs在多种细胞株中的表达;结合GO和KEGG确定4种miRNAs的靶基因。利用CCK-8法检测各组细胞的活力;利用双荧光素酶报告基因验证miRNAs与对应靶基因的作用关系。结果通过TCGA结合文献筛选差异的miRNAs分别为hsa-miR-122、hsa-miR-133b、hsa-miR-449a和hsa-miR-767。根据GO和KEGG分析hsa-miR-122-5p、hsa-miR-133b-5p、hsa-miR-449a-5p和hsa-miR-767-5p的靶基因分别为ESR1、EGFR、HMGB1和IGF-1。与mimics-NC组(1.52±0.01)比较,mimics hsa-miR-122组(1.75±0.01)、mimics hsa-miR-767组(1.87±0)和mimics hsa-miR-449a组(1.71±0.01)的细胞活力显著升高(P荧光活性比值(P荧光活性比值(P荧光活性比值(P荧光活性比值(P<0.0001);IGF-1表达与患者年龄、原发肿瘤分期有相关性(P<0.05)。结论乳腺癌细胞株中4种差异表达的miRNAs分别与ESR1、EGFR、HMGB1和IGF-1靶向结合,IGF-1表达与患者年龄、原发肿瘤分期有相关性。

关键词：乳腺肿瘤 miRNAs-mRNA 靶基因双荧光素酶

海南黑山羊MBL2基因的转录调控元件的筛选与分析

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畜牧兽医学报 2022年第6期53卷 1795-1806页

作者：王雪梅翟哲陈巧玲吴艳茹吴昊天黄惠娴刘志勇李崇瑞满初日嘎王凤阳杜丽陈思海南大学动物科技学院海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室海口市动物基因工程重点实验室海口570228

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca^(2+)依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1009 bp)的重要转录因子,探寻该... 详细信息

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca^(2+)依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1009 bp的启动子5′端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P<0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。

关键词：海南黑山羊 MBL2基因转录调控双荧光素酶核心启动子

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验证转录因子与靶基因启动子互作的科技实践

中学生物教学 2022年第8期 55-57页

作者：刘琳琳湖北省武汉市光谷第二高级中学 430074

在验证转录因子与靶基因启动子互作的科技实践中,以双荧光素酶瞬时表达体系为载体,在成功建立烟草双荧光素酶瞬时表达体系的基础上,进一步验证了MYB转录因子与其靶基因的互作关系,有效提高了学生的抽象思维、推理判断和实践能力,使学生... 详细信息

在验证转录因子与靶基因启动子互作的科技实践中,以双荧光素酶瞬时表达体系为载体,在成功建立烟草双荧光素酶瞬时表达体系的基础上,进一步验证了MYB转录因子与其靶基因的互作关系,有效提高了学生的抽象思维、推理判断和实践能力,使学生了解生命的精巧并激发学生的生物学学习热情。

关键词：科技实践双荧光素酶转录因子启动子

牡丹蔗糖转运蛋白基因PsSUT2启动子的克隆及其互作转录因子的筛选

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牡丹蔗糖转运蛋白基因PsSUT2启动子的克隆及其互作转录因子的筛选

作者：韩静静河南农业大学

学位级别：硕士

牡丹(Paeonia suffruticosa)属多年生落叶灌木,以其丰富的花型、硕大的花冠和鲜艳的花色而备受青睐。然而,牡丹盆栽种植后常常出现植株矮小、花蕾败育的现象,严重影响了其观赏价值,这已成为盆栽牡丹产业化发展中的瓶颈问题。课题组在前... 详细信息

牡丹(Paeonia suffruticosa)属多年生落叶灌木,以其丰富的花型、硕大的花冠和鲜艳的花色而备受青睐。然而,牡丹盆栽种植后常常出现植株矮小、花蕾败育的现象,严重影响了其观赏价值,这已成为盆栽牡丹产业化发展中的瓶颈问题。课题组在前期研究中发现蔗糖在盆栽牡丹生长发育中扮演重要角色,并克隆出与牡丹蔗糖转运相关的PsSUT2基因c DNA全长,并对它的功能进行研究。本研究从盛花期‘洛阳红’牡丹的花瓣中克隆出PsSUT2基因启动子序列,并对其顺式作用元件进行分析,利用GUS组织化学染色以及GUS实时定量表达分析来检测PsSUT2基因启动子的活性,推测启动子核心关键区域,根据启动子上的顺式作用元件与WGCNA构建共表达网络结合,预测出潜在调控PsSUT2的转录因子,然后对潜在转录因子进行表达分析与克隆,之后通过酵母单杂和双荧光素酶试验筛选出与目标启动子互作的转录因子,并对其进行生物信息学分析,初步预测其结构与功能上的特征,具体研究结果如下:(1)从‘洛阳红’牡丹盛花期的花瓣中克隆得到了蔗糖转运蛋白基因PsSUT2启动子序列,总长为1 819 bp。利用在线数据库Plant CARE分析该启动子上可能存在的顺式作用元件,预测结果包括核心元件TATA-box、CAAT-box以及参与脱落酸响应、光响应、干旱诱导、低温响应、赤霉素响应、茉莉酸甲酯响应的顺式作用元件。(2)根据顺式作用元件所在位置将PsSUT2基因启动子从5’端逐段缺失4段,长度分别为:1 255 bp、641 bp、260 bp和109 bp,并融合到p BI121-35s-GUS载体。通过GUS组织化学染色和GUS实时定量表达分析证明PsSUT2启动子具有活性,并推测核心区域位于-260 bp～-109 bp之间。(3)通过WGCNA分析构建基因共表达模块,经鉴定PsSUT2基因位于黄色模块,其中9个转录因子与PsSUT2表达模式最接近,结合顺式作用元件预测结果信息,初步确定6个潜在调控转录因子,分别为:PsCCCH30、PsMYB20、PsMADS9、PsWRKY20、Psb HLH3、PsBIM1。(4)通过实时荧光定量试验测定筛选出来的6个潜在调控转录因子与PsSUT2基因的表达量,结果表明6个转录因子与PsSUT2基因的表达模式相似,且相对表达量相关性系数中位数为0.86,与预测结果基本一致。之后成功克隆PsCCCH30,长度2 151 bp;PsMYB20,长度891 bp;PsMADS9,长度603 bp;PsWRKY20,长度1 677 bp;Psb HLH3,长度1 731bp;PsBIM1,长度1 539 bp。(5)成功构建PsSUT2启动子与p Lac Zi重组表达载体和PsCCCH30、PsMYB20、PsMADS9、PsWRKY20、Psb HLH3、PsBIM1与p B42AD重组表达载体,转化酵母感受态,酵母单杂结果显示PsMADS9和PsMYB20与PsSUT2基因启动子存在互作的关系,能够激活PsSUT2基因的表达;成功构建PsSUT2与p GreenⅡ0800-LUC植物表达载体和PsCCCH30、PsMYB20、PsMADS9、PsWRKY20、Psb HLH3、PsBIM1的p GreenⅡ62-SK植物表达载体,瞬时转化烟草,通过双荧光素酶试验再次验证PsMADS9和PsMYB20能够与PsSUT2基因启动子序列结合,并正向调控PsSUT2的表达。(6)通过生物信息学分析发现,PsMYB20蛋白的等电点为8.48,不稳定系数是49.70,属于不稳定蛋白,没有跨膜结构,为亲水性蛋白,亚细胞定位预测PsMYB蛋白位于细胞核和叶绿体;PsMADS9等电点为9.43,不稳定系数是32.00,属于稳定蛋白,没有跨膜结构,为亲水性蛋白,亚细胞定位预测PsMADS9蛋白位于细胞核。

关键词：牡丹启动子 WGCNA GUS染色酵母单杂双荧光素酶

厚朴麻黄汤干预OVA诱导哮喘小鼠效应及基于β2AR调控的功效物质研究

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厚朴麻黄汤干预OVA诱导哮喘小鼠效应及基于β2AR调控的功效物质研...

作者：倪瑛南京中医药大学

学位级别：硕士

研究目的探讨厚朴麻黄汤干预卵蛋白（OVA）诱导哮喘小鼠的效应,并从β2肾上腺素受体（β2AR）的调控探讨该方及各部位的效应机制,为该方临床研究提供理论依据。研究方法1.复制OVA诱导哮喘小鼠模型,采用厚朴麻黄汤对其干预,观察该方干预... 详细信息

研究目的探讨厚朴麻黄汤干预卵蛋白（OVA）诱导哮喘小鼠的效应,并从β2肾上腺素受体（β2AR）的调控探讨该方及各部位的效应机制,为该方临床研究提供理论依据。研究方法1.复制OVA诱导哮喘小鼠模型,采用厚朴麻黄汤对其干预,观察该方干预后经乙酰胆碱（Ach）激发的增强呼气间歇（Penh）变化、外周血和支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞（EOS）水平、肺病理损伤,ELISA测定BALF中炎症因子与介质的变化,qPCR、Western Blot（WB）法检测小鼠β2AR/β-arrestin2及紧密连接（TJs）mRNA和蛋白表达。2.复制OVA诱导哮喘小鼠模型,采用厚朴麻黄汤及石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、剩余水5个萃取部位对其干预,观察干预后经Ach激发的Penh变化、外周血EOS和BALF中白细胞水平、肺病理损伤,ELISA测定BALF中白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-13（IL-13）水平的变化,qPCR检测小鼠β2AR/β-arrestin2 mRNA表达;并通过体外β2AR质粒转染293T细胞,双荧光素酶报告基因检测各部位对β2AR的激动作用,获得优效部位,与整体实验相互验证。3.对厚朴麻黄汤及优效部位进行UPLC-TQ/MS检测,确定其中的化学成分,通过分子对接将确定成分与β2AR靶点进行虚拟对接。将亲和力得分较高的成分及优效部位的成分进行相互结合,通过双荧光素酶报告基因检测化学成分对β2AR的激动作用。研究结果1.厚朴麻黄汤对OVA诱导小鼠哮喘的影响:对OVA诱导哮喘小鼠模型干预后,①气道高反应性Penh值显示:模型组小鼠明显升高;当6.25 g/L浓度Ach时,各给药组明显降低,且中剂量组显著降低;12.5 g/L浓度Ach时,厚朴麻黄汤低、中剂量组显著降低;25 g/L浓度Ach时,各给药组明显降低且中剂量组显著降低;50 g/L浓度Ach时,各给药组显著降低。②外周血EOS数量及BALF中EOS百分占比:模型组两指标均显著增高,各给药组外周血EOS数显著降低;厚朴麻黄汤中、高剂量组BALF中EOS百分占比显著降低。③肺组织病理变化:模型组小鼠支气管壁有大量炎症细胞浸润,支气管黏膜水肿、增厚,管腔狭窄,黏液分泌增多,支气管纤毛上皮部分脱落;各给药组的肺组织病理出现不同程度减轻,且厚朴麻黄汤中剂量组减轻最明显。④IL-4,IL-13,PGD2,SP水平变化:模型组明显升高;厚朴麻黄汤中剂量组及阳性药组IL-4水平显著降低,厚朴麻黄汤低、高剂量组明显降低;厚朴麻黄汤中、高剂量组和阳性药组IL-13水平显著降低;厚朴麻黄汤三个剂量组、阳性药组PGD2水平显著降低,厚朴麻黄汤中、高剂量组和阳性药组SP水平显著降低。⑤β2AR/β-arrestin2和TJs相关基因与蛋白表达:模型组β2AR/β-arrestin2基因与蛋白表达显著降低;ZO-1、occludin基因与蛋白表达明显降低,claudin-2表达明显升高;各给药组β2AR/β-arrestin2明显改善,且紧密连接相关蛋白基因出现回调（以上结果均P＜0.05）。2.厚朴麻黄汤各萃取部位对OVA诱导小鼠哮喘的影响及对β2AR的激动作用的筛选:①气道高反应性Penh值显示:模型组小鼠显著升高,各给药组均出现不同程度降低。②外周血EOS数量及BALF中白细胞数量:模型组的外周血EOS数量显著增高,沙丁胺醇组、厚朴麻黄汤组、乙酸乙酯组和正丁醇组外周血EOS数量显著降低,剩余水组明显降低;模型组BALF中白细胞数量显著增高,其他各给药组白细胞数量明显降低。③肺组织病理变化:空白组病理学改变不明显,肺泡壁内无充血、水肿的情况,气道上皮细胞无损伤情况;模型组中有大量炎细胞浸润在支气管周围,支气管的上皮细胞变性坏死、管壁增厚、管腔内大量黏液;各给药组病理出现不同程度的减轻。④IL-4,IL-13水平变化:模型组IL-4、IL-13水平均显著升高,IL-4水平在沙丁胺醇组、厚朴麻黄汤组及乙酸乙酯组显著降低,正丁醇组、剩余水组明显降低;IL-13水平在沙丁胺醇组显著降低,厚朴麻黄汤组、乙酸乙酯组及正丁醇组明显降低。⑤β2AR/β-arrestin2基因表达:模型组β2AR/β-arrestin2 mRNA表达显著降低,β2AR mRNA中沙丁胺醇组、厚朴麻黄汤组、石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组显著升高,氯仿组、剩余水组明显升高;β-arrestin2 mRNA中沙丁胺醇组、厚朴麻黄汤组显著升高,乙酸乙酯组、正丁醇组明显升高。⑥厚朴麻黄汤及各部位安全浓度筛选:通过CCK8筛选药物浓度,最终选取厚朴麻黄汤55、70、85μg/mL,石油醚部位2.5、5、10μg/mL,氯仿部位10、20、30 μg/mL,乙酸乙酯部位60、80、100μg/mL,正丁醇部位10、20、30 μg/mL,剩余水部位60、80、100 μg/mL,沙丁胺醇浓度为40 μmol/L。

关键词：厚朴麻黄汤支气管哮喘优效部位 β2AR 双荧光素酶

家蚕miR-301对化学感受蛋白基因csp9表达的调控

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昆虫学报 2018年第10期61卷 1145-1152页

作者：杨娟娟王远卓魏博帆邢秋婷阚云超乔惠丽南阳师范学院河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室昆虫生物反应器河南省工程实验室河南南阳473061

【目的】探索家蚕Bombyx mori miRNAs对化学感受蛋白基因表达的调控作用,以进一步研究miRNAs及其靶基因在昆虫化学识别中的作用。【方法】利用生物信息学方法预测和筛选可能作用于家蚕化学感受蛋白CSPs基因家族成员的miRNAs;实时荧光定... 详细信息

【目的】探索家蚕Bombyx mori miRNAs对化学感受蛋白基因表达的调控作用,以进一步研究miRNAs及其靶基因在昆虫化学识别中的作用。【方法】利用生物信息学方法预测和筛选可能作用于家蚕化学感受蛋白CSPs基因家族成员的miRNAs;实时荧光定量PCR分析预测获得的候选miR-301和其作用的靶基因在家蚕成虫不同组织中的表达变化;构建miR-301预测靶基因3′-UTR的双荧光素酶报告载体,与合成的miR-301 mimics或阴性对照转染人胚肾细胞HEK293,通过双荧光素酶报告基因检测系统中荧光素酶活性变化检测miR-301对其靶基因表达的调控作用。【结果】生物信息学分析结果发现,家蚕化学感受蛋白基因csp9是miR-301的预测靶基因,二者的结合位点位于csp9的3′-UTR区。实时荧光定量PCR检测结果表明,miR-301在交配后家蚕雌雄成虫触角和雄成虫头部都显著上调表达,靶基因csp9在对应组织中表达则显著下调。二者共转染HEK293细胞后,双荧光素酶检测结果表明,miR-301可以通过与csp9 3′-UTR的互作,显著抑制上游荧光素酶报告基因的表达。【结论】家蚕化学感受蛋白基因csp9是miR-301的靶基因,miR-301通过与靶基因3′-UTR的结合,在翻译水平上抑制csp9的表达。

关键词：家蚕 miRNA 化学感受蛋白靶基因实时荧光定量PCR 双荧光素酶