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十字花科黑腐病菌一对假定的双组份信号转导系统基因的功能研究

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十字花科黑腐病菌一对假定的双组份信号转导系统基因的功能研究

作者：潘俊霞广西大学

学位级别：硕士

十字花科黑腐病菌,学名野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris,简称Xcc),是一种能在世界范围内引起十字花科植物产生黑腐病的革兰氏阴性病原菌,也是研究植物与微生物相互作用的模式细菌之一。双组份信号... 详细信息

十字花科黑腐病菌,学名野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris,简称Xcc),是一种能在世界范围内引起十字花科植物产生黑腐病的革兰氏阴性病原菌,也是研究植物与微生物相互作用的模式细菌之一。双组份信号转导系统(Two-component signal transduction systems,简称TCSs)是微生物感受外界信号的最重要的信号传导系统。典型的双组份信号转导系统由两部份构成,其中一部份主要是感受外界环境刺激的组氨酸激酶感受蛋白(histidine kinase, HK);另一部份是执行着调控下游基因表达的作用的响应调节蛋白(response-regulator protein, RR)。基因组分析表明,Xcc 8004共有111个双组份信号转导系统基因,目前仍有很多双组份信号转导系统基因的功能还不清楚,包括XC3067和XC3068这对推测的双组份信号调控系统基因。生物信息学分析表明,XC3067和XC3068在Xcc 8004基因组上相邻,转录方向一致,两个基因间重叠14 bp,XC3067编码一个杂合双组份系统响应调节蛋白,XC3068编码一个双组份系统的感受蛋白。在前期的研究中发现,XC3068基因的Tn5gusA5的插入突变体与致病相关,为了进一步研究XC3067和XC3068这对双组份信号转导系统的生物学功能,利用同源双交换的策略,分别构建了XC3067和XC3068的缺失突变体DM3067和DM3068,及双缺失突变体DM3067/3068。测定生长曲线实验结果显示,与野生型菌株相比,突变体DM3067、DM3068和DM3067/3068在基本培养基和丰富培养基中的生长没有变化;致病生化因子检测实验结果显示,与野生型菌株相比,突变体DM3067、DM3068和DM3067/3068的胞外多糖、胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外纤维素酶和游动性等均没有显著差异;抗逆性检测实验结果显示,与野生型菌株相比,DM3067、DM3068和DM3067/3068耐受蛋白质变性剂的能力下降,渗透压抗性和有机溶剂抗性没有变化;在寄主满身红萝卜的致病性检测实验结果表明,与野生型菌株相比,突变体DM3068和DM3067/3068的致病力有显著变化;在非寄主辣椒上的过敏反应实验检测结果表明,与野生型菌株相比,突变体DM3067和DM3068的过敏反应减弱。DM3067和DM3068的反式互补菌能基本回复表型至野生型水平,表明XC3068与致病性相关,而XC3067和XC3068与过敏反应和蛋白质变性剂抗性相关。RT-PCR实验结果表明,XC3067和XC3068位于同一转录单元,很可能组成一个双组份信号转导系统。RT-PCR实验结果还表明,XC3067和XC3068在MMX的表达量与在NYGB中的表达量一致,在MMX条件下中不受hrpG和hrpX调控。本研究结果显示XC3067和XC3068这对推测的双组份信号转导系统基因可能与野生型的致病力、过敏反应和蛋白质变性剂抗性相关。并且XC3067和XC3068位于同一转录单元,不被MMX诱导表达,不被hrpG和hrpX在MMX培养基条件下调控。

关键词：十字花科黑腐病菌双组份信号转导系统致病性过敏反应耐受性

苏云金芽胞杆菌双组份信号转导系统YvcPQ的调控机制与功能研究

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苏云金芽胞杆菌双组份信号转导系统YvcPQ的调控机制与功能研究

作者：张舒梦华中农业大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是广泛应用的微生物杀虫剂,可用于防治鞘翅目、直翅目、双翅目、膜翅目和鳞翅目的多种害虫,具有杀虫效果好和对人类畜类安全等优点。双组份信号转导系统(Two-component signal transduction syst... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是广泛应用的微生物杀虫剂,可用于防治鞘翅目、直翅目、双翅目、膜翅目和鳞翅目的多种害虫,具有杀虫效果好和对人类畜类安全等优点。双组份信号转导系统(Two-component signal transduction system,TCS)简称双组份,是原核生物主要的信号转导系统,参与调控细菌的多种生理过程,如细菌的生长、芽胞形成、渗透压、抗生素抗性、趋化性、毒性、致病性以及营养元素的代谢等。大多数双组份由一对蛋白质组成,分别是位于细胞膜的组氨酸激酶(Histidine kinases)和位于细胞质的响应调节子(Response regulator)。组氨酸激酶能够感应环境中或细胞内的某种信号刺激,并发生自磷酸化,然后将磷酸基团传递给其对应的响应调节子,使响应调节子被激活;有活性的响应调节子能够作为转录因子去调控与该种信号刺激相关的基因的表达,使细胞对相应的信号刺激做出响应。双组份YvcPQ由组氨酸激酶YvcQ和响应调节子YvcP组成。目前关于YvcPQ的研究很少,主要集中在***菌群的***中,而关于包括***在内的Bacillus cereus菌群的YvcPQ的研究几乎是一片空白,因此本课题选取***中的YvcPQ作为主要的研究对象,深入探究YvcPQ相关的转录调控机制和生物学功能。本课题采用生物信息学分析、归巢内切酶介导的基因无痕敲除、细菌单杂交、凝胶阻滞和实时荧光定量PCR等方法主要完成了以下几个方面的工作:1)采用生物信息学的方法分析了yvcPQ及其下游基因在芽胞杆菌属中的分布,发现芽胞杆菌属中的yvcPQ及其下游基因可以大致分为三大类,第一类是以*** W168为代表的yvcPQ-RS,主要存在***菌群的***中;第二类是以*** BMB171为代表的yvcPQ-R-S1S2,主要存在于***菌群中;第三类是不同于上述两类的特殊的基因。此外,***菌群和***菌群的yvcPQ及其下游基因也存在很大的差异,其相似性在50%以下。2)根据YvcP识别的核苷酸序列,在***菌群的*** BMB171中找到了4个受YvcPQ调控的基因(yvcR、BMB171＿C4385、kapD和BMB171＿C4835),并在体外通过细菌单杂交实验验证了YvcP与4个基因启动子区DNA的结合,在体内通过实时荧光定量PCR实验验证了YvcP对4个基因的转录调控。3)通过将*** BMB171中yvcPQ的下游基因及其功能与*** W168中的相比较,阐释了***中YvcPQ对杆菌肽的响应机制,发现YvcPQ不仅能够调控yvcR的转录,还能够调控位于yvcR下游的yvcS1S2操纵子的转录,从而帮助细胞响应杆菌肽刺激,解除杆菌肽对细胞的毒性作用。4)采用细菌单杂交、凝胶阻滞和实时荧光定量PCR等方法,阐释了***中YvcPQ参与的一种芽胞形成的抑制机制,即:时期调控因子AbrB能够通过正调控yvcPQ操纵子的转录来提高细胞内的YvcP水平,进而增强YvcP对芽胞形成抑制因子基因kapD的转录激活,最终抑制芽胞的形成。5)采用归巢内切酶介导的基因无痕敲除方法得到了△yvcPQ和△kapD两株提前形成芽胞的基因突变株,为发酵周期短、成本低的新型基因工程菌株的构建奠定了基础。总之,本课题的研究结果揭示了双组份YvcPQ的多种类型和功能,为***甚至***菌群中YvcPQ的研究提供了新的思路,本课题也为双组份信号转导系统的功能以及细菌芽胞形成的调控的研究奠定了基础。

关键词：苏云金芽胞杆菌双组份信号转导系统 YvcPQ 抗性机理杆菌肽芽胞形成

水产品腐败希瓦氏菌双组分信号转导系统的全基因组鉴定与分析

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中国食品学报 2022年第6期22卷 289-298页

作者：李秋莹张婧阳徐瑾秀孙彤李学鹏励建荣渤海大学食品科学与工程学院辽宁锦州121013 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州121013

腐败希瓦氏菌是水产品中的一种特定腐败菌,具有较强的低温适应性和致腐性。双组分信号转导系统(TCSs)是细菌中重要的调控系统之一,在细菌对复杂环境的感知和响应中起重要的作用。为探究TCSs在腐败希瓦氏菌中的分布及功能,本文采用全基... 详细信息

腐败希瓦氏菌是水产品中的一种特定腐败菌,具有较强的低温适应性和致腐性。双组分信号转导系统(TCSs)是细菌中重要的调控系统之一,在细菌对复杂环境的感知和响应中起重要的作用。为探究TCSs在腐败希瓦氏菌中的分布及功能,本文采用全基因组鉴定、多序列比对、系统进化树分析、蛋白结构预测以及互作蛋白分析等多种生物信息学方法,系统分析水产品腐败希瓦氏菌中TCSs的分布、分类、结构与功能。结果表明:水产品腐败希瓦氏菌WS13菌株中存在31个组氨酸激酶(HKs)、36个反应调节蛋白(RRs)、3个成对TCSs、3个融合HKs。HKs共有16种结构域组成形式,其中15种均含有HATPase_c激酶催化结构域。RRs具有10种结构域组成,均含有REC结构域。多序列比对和进化分析表明:不同结构域的HKs和RRs具有不同的进化关系,可能存在功能的多样性。3对TCSs和3个融合HKs的生物学功能主要参与响应信号刺激,调控细胞内的各种代谢过程以及物质的运输等。3个融合HKs均与三甲胺生成相关。研究结果为进一步探究TCSs在水产品腐败希瓦氏菌中的功能提供理论参考。

关键词：水产品腐败希瓦氏菌双组份信号转导系统生物信息学

srtA基因调节变异链球菌氧化耐受的机制研究

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口腔疾病防治 2020年第5期28卷 292-297页

作者：何远丽任彪陈璇邹玲口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院四川成都610041 口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科四川成都610041

目的探究srtA基因对变异链球菌氧化耐受能力的调节作用并初步探讨其机制。方法通过氧化耐受实验,对比变异链球菌UA159菌株及其srtA基因缺失株及回复株在浮游及生物膜状态下的氧化耐受能力差异;用Illumina Hiseq 4000测序平台对UA159菌... 详细信息

目的探究srtA基因对变异链球菌氧化耐受能力的调节作用并初步探讨其机制。方法通过氧化耐受实验,对比变异链球菌UA159菌株及其srtA基因缺失株及回复株在浮游及生物膜状态下的氧化耐受能力差异;用Illumina Hiseq 4000测序平台对UA159菌株及其srtA基因缺失株在对数中期及稳定期的基因转录组测序,比较其氧化耐受相关基因的转录表达差异,进一步探讨srtA基因缺失后变异链球菌氧化耐受能力的变化与其基因转录组的内在联系;并采用qPCR来验证相关基因表达水平的变化。结果srtA基因缺失后变异链球菌在浮游状态、生物膜状态的氧化耐受能力均较UA159降低(P双组份信号转导系统编码基因lrgA、lrgB、lytT表达下调2.2~2.4倍;qPCR结果进一步表明对数中期、稳定期的浮游菌lrgB、lytT表达下调11.01~53.51倍,且另一双组分系统编码基因vicK表达下调6.57~10.88倍(P<0.001)。结论srtA基因缺失后,变异链球菌过氧化物合成及代谢酶类编码基因表达水平不变,但氧化耐受相关转录调节因子表达水平下降,进而减弱变异链球菌的氧化耐受能力。

关键词：变异链球菌龋病生物膜分选酶A srtA基因氧化应激氧化耐受活性氧转录组测序双组份信号转导系统

孤儿反应调节因子Rv3143调控结核分枝杆菌药物敏感性的机制研究

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孤儿反应调节因子Rv3143调控结核分枝杆菌药物敏感性的机制研究

作者：王瑞华中农业大学

学位级别：硕士

结核病(tuberculosis,TB)是人或动物主要感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)而引起的传染病。有研究表明,双组份信号转导系统中的孤儿反应调节因子Rv3143与结核分枝杆菌的耐药性有关,但是Rv3143基因与药物的相互作用机制尚... 详细信息

结核病(tuberculosis,TB)是人或动物主要感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)而引起的传染病。有研究表明,双组份信号转导系统中的孤儿反应调节因子Rv3143与结核分枝杆菌的耐药性有关,但是Rv3143基因与药物的相互作用机制尚不清楚。本研究中,我们通过在耻垢分枝杆菌上构建Rv3143的重组菌株,并对重组菌株在药物刺激下引起的差异反应进行了研究,确定了Rv3143能够调节结核分枝杆菌的药物敏感性。***3143增加了分枝杆菌对药物的敏感性本研究通过测定H37Ra、H37Ra-△Rv3143和H37Ra-Rv3143菌株的细胞活性及mc2155、mc2155-p MV261和mc2155-Rv3143菌株的MIC值,发现药物对互补菌株H37Ra-Rv3143的抑制率高于野生菌株和缺失菌株,mc2155-Rv3143的MIC值均低于mc2155和mc2155-p MV261的MIC值。通过测定mc2155-p MV261和mc2155-Rv3143菌株的OD600以及CFU与时间的对应关系曲线,发现mc2155-p MV261和mc2155-Rv3143在正常培养情况下生长特性没有显著的差异,但当RIF刺激培养时,mc2155-Rv3143菌株比mc2155-p MV261菌株生长更加缓慢。上述结果共同显示,Rv3143增加了结核分枝杆菌对药物的敏感性。***3143增强了耻垢分枝杆菌细胞内的存活能力和药物敏感性在细胞内的药敏实验中,通过测定细胞内mc2155-pMV261和mc2155-Rv3143的CFU,检测细菌的胞内存活情况。结果发现在感染细胞后48h和72h时mc2155-Rv3143菌株表现出更强的细胞内存活能力;但当利福平(RIF)存在时,mc2155-Rv3143菌株在巨噬细胞内的生长受到了明显的抑制。说明Rv3143能够增强了耻垢分枝杆菌细胞内的存活能力,但在RIF处理时胞内存活能力显著性下降。3.耻垢分枝杆菌的Rv3143过表达菌株在RIF刺激下引起的差异基因的分析和筛选利用转录组测序技术对mc2155-pMV261和mc2155-Rv3143在药物刺激下引起的差异基因的确定,共筛选出2356个差异基因。并将这些基因根据基因功能分为与细胞壁合成、信号通路、脂代谢和呼吸代谢等相关的10类。并从差异基因中筛选出基因功能中差异表达高的基因,即MSMEG740、MSMEG615、MSMEG130等15个Rv3143潜在调控的基因。***3143蛋白结合MSMEG740基因通过纯化表达的Rv3143蛋白,利用表面等离子共振技术对转录组测序结果中潜在的调控的基因进行筛选,并用EMSA实验对筛选结果进行进一步的验证,最终成功的筛选到了MSMEG740基因为Rv3143蛋白特定结合并调控的基因。***3143增加了耻垢分枝杆菌细胞壁的通透性通过测定mc2155-p MV261和mc2155-Rv3143菌株对EB的积累后的荧光强度,探索细菌细胞壁通透性的改变。发现mc2155-Rv3143比mc2155-p MV261的荧光强度更强,说明Rv3143能够增加菌株细胞壁的通透性。

关键词：分枝杆菌双组份信号转导系统 Rv3143 药物敏感性

吸水链霉菌5008部分双组份系统的初步研究

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吸水链霉菌5008部分双组份系统的初步研究

作者：高璐璐山东大学

学位级别：硕士

双组份信号转导系统(Two-component Signal Transduction System,TCSs)普遍存在于原核生物中,是细菌非常重要的信号转导系统。TCSs调控细菌细胞中大多数生理和生化过程,包括细菌营养元素的代谢、酶合成、孢子形成、细胞的发育分化及次... 详细信息

双组份信号转导系统(Two-component Signal Transduction System,TCSs)普遍存在于原核生物中,是细菌非常重要的信号转导系统。TCSs调控细菌细胞中大多数生理和生化过程,包括细菌营养元素的代谢、酶合成、孢子形成、细胞的发育分化及次级代谢产物的合成等。目前TCSs的基本构成和传递信号的过程已被大家所熟知,但TCSs的复杂性给研究工作带来很多困难,大部分TCSs的调控机理仍需要进一步的研究。链霉菌具有特殊的遗传和代谢特征,具有复杂的生长周期,一直是生物界最活跃的研究领域之一。不仅如此,链霉菌还能够产生许多种抗生素和胞外酶等次级代谢产物,是最具有商用价值的工业微生物类群之一。因此,研究调控链霉菌次级代谢途径、提高次级代谢产物产量的方法具有广阔的应用前景和经济价值。而本研究的实验材料就是一种非常典型的链霉菌——吸水链霉菌井岗变种5008。吸水链霉菌5008的全基因组已测序。序列分析显示,吸水链霉菌5008全基因组中有53对成对TCSs和28个未配对的组分。本研究选取几对TCSs,对他们的功能进行了研究。本研究首先扩增目的基因左右臂,构建重组穿梭质粒,通过大肠杆菌与链霉菌之间的跨属接合转移获得目的片段缺失的突变菌株。随后进行表型观察和产素比较,筛选有突出表型的突变菌株,进行转录和翻译水平的研究,以期获得抗生素高产菌株或产孢明显变化的菌株,进一步了解双组份系统的调控机理。本研究最终获得了 5株TCSs基因缺失突变菌株:ΔSHJG1922,ASHJG4305/4306,ΔSHJG4527/4528,ΔSHJG4927/4928,ΔSHJG6929。表型分析显示,与野生型菌株相比,缺失突变菌株ASHJG4527/4528,菌落形态和孢子产生情况差别很明显,且抑制玉米小斑病菌的活性明显比野生型菌株强,因此我们推测双组份信号系统SHJG4527/4528可能调控产孢相关基因的表达。此外,通过高效液相色谱分析,发现缺失突变菌株A6929产井冈霉素素较野生型菌株多,因此我们推测双组份信号转导孤立基因SHJG6929可能在井冈霉素的合成过程起着负调控的作用。

关键词：双组份信号转导系统吸水链霉菌5008 井冈霉素

组氨酸激酶HisK2301与红冬孢酵母低温适应性的关系

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组氨酸激酶HisK2301与红冬孢酵母低温适应性的关系

作者：杨晓霞昆明理工大学

学位级别：硕士

组氨酸激酶(Histidine kinases,HK)是一种跨膜转移酶类蛋白质,在信号转导过程中可作为信号分子的细胞受体。原核生物中的HKs一般由ATP结合区(histidine kinase-like ATPase catalytic domain,HATPase)及二聚化组氨酸磷酸转移结构域(hist... 详细信息

组氨酸激酶(Histidine kinases,HK)是一种跨膜转移酶类蛋白质,在信号转导过程中可作为信号分子的细胞受体。原核生物中的HKs一般由ATP结合区(histidine kinase-like ATPase catalytic domain,HATPase)及二聚化组氨酸磷酸转移结构域(histidine kinase domain,HisKA)两个保守的结构域组成,真核生物中HKs除了HATPase和HisKA区域外,还具有信号接收区域(receiver domain,RD/REC)来接收并传递信号。在信号传递过程中,HKs感受器感受外界环境的变化后,ATP作为磷酸供体,结合HATPase结构域,引起HATPase结构域的His残基发生自体磷酸化。HKs 一般通过双组份信号转导系统(Two-component signal transduction systems,TCSs)来传递信号,双组份信号转导系统普遍存在于原核和真核生物中,主要由一个HK和一个应答调控蛋白(response regulator protein,RR)组成。双组份信号转导途径包括信号输入、组氨酸激酶自身磷酸化、应答调控蛋白磷酸化和信号输出等环节。细胞内外的环境信号引起组氨酸激酶保守的组氨酸残基发生自动磷酸化,再将磷酸基团转移到应答调控蛋白的天冬氨酸残基上,进而引起下游基因转录和翻译水平发生改变。双组份信号转导系统参与细胞生长、胁迫抗性、次级代谢产物调控、维持细胞毒力等多种机制的调控。本课题对一株具有低温生长适应性的产油酵母一红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovaae)菌株YM25235 在 15℃和 30℃培养条件下的样品进行转录组测序分析,研究该菌株低温生长适应性机制,结果显示,低温条件下YM25235菌株生长与MAPK级联信号途径呈显著相关。对MAPK级联信号通路分析发现,其检测到的73个基因中11个基因发生2倍以上的差异表达,其中9个呈下调,特别是与渗透压胁迫相关的信号转导途径中的基因均呈下调。此外,我们进一步对YM25235菌株中潜在的5个组氨酸激酶进行分析发现,仅组氨酸激酶HisK2301与菌株低温生长适应性有关,荧光定量PCR初步分析结果表明HisK2301 基因mRNA在15℃的表达水平是30℃时的2.6倍。因此推测基于组氨酸激酶HisK2301的双组份信号转导系统可能与红冬孢酵母YM25235菌株的低温生长适应性有关。根据转录组测序所获得的组氨酸激酶基因HisK2301序列设计基因特异性引物,通过PCR扩增得到全长为3888bp的cDNA序列,序列分析结果表明其具有一个编码1295个氨基酸的完整开放阅读框。通过对其编码蛋白的组氨酸激酶HisK2301的氨基酸序列分析发现,其具有保守的HisKA、HATPase和REC三种组氨酸激酶结构域,N端还具有LCR结构域和6个HAMP结构域。进一步分析发现组氨酸激酶HisK2301具有两个潜在的跨膜区域,同时通过构建HisK2301的GFP融合蛋白也证实了 HisK2301是一种膜结合蛋白。这些结果初步表明组氨酸激酶基因HisK2301是一个新的潜在的具有膜结合区域的第三类真菌杂合型组氨酸激酶编码基因,而且说明真菌中的第三类组氨酸激酶不再局限于之前报道的定位于细胞质中的可溶性蛋白。为了验证组氨酸激酶基因HisK2301与低温生长适应的关系,我们首先将该基因分别插入pYES3/CT和pRH2304两个载体中,构建重组表达质粒pY3HisK2301和pRHHisK2301,经验证正确后分别转入酿酒酵母INVScl和红冬孢酵母YM25235菌株中进行表达,分析组氨酸激酶HisK2301对酵母菌株抗低温、高渗透压、盐压、过氧化压以及金属离子胁迫下的影响。结果表明,组氨酸激酶基因HisK2301能促进转基因酿酒酵母INVScl和红冬孢酵母YM25235的低温、高渗透压以及盐压的胁迫抗性。我们进一步将N端跨膜区包括LCR结构域的序列进行缺失并对缺失突变体在酿酒酵母INVScl中的功能进行分析。结果表明,缺失突变基因不能提高转基因菌株的环境胁迫抗性,这可能与跨膜区缺失导致组氨酸激酶HisK2301无法定位到细胞膜而失去对环境胁迫的感知有关。对组氨酸激酶基因HisK2301转化的红冬孢酵母YM25235过表达菌株进行脂肪酸气相色谱分析结果发现,15℃条件下基因HisK2301转化的YM25235菌株中亚油酸和α-亚麻酸含量分别较空质粒pRH2304转化菌株增加了 5.06%和1.56%,而且油酸含量减少3.6%。我们进一步对催化油酸转变为亚油酸和α-亚麻酸的限速酶△12-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA表达水平进行定量分析,结果表明在15℃时该基因mRNA表达水平明显提

关键词：红冬孢酵母组氨酸激酶胁迫抗性低温生长适应性双组份信号转导系统 △12-脂肪酸脱氢酶基因多不饱和脂肪酸

天蓝色链霉菌双组分信号转导系统SCO2120/SCO2121的功能研究

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天蓝色链霉菌双组分信号转导系统SCO2120/SCO2121的功能研究

作者：于晓秋山东大学

学位级别：硕士

链霉菌属于革兰氏阳性细菌,能够合成多种具有生物活性的次级代谢产物,例如抗生素、抗肿瘤物质以及免疫抑制剂等。链霉菌的模式菌株—天蓝色链霉菌的基因组已于2002年完成测序,序列分析表明其基因组中含有多个次级代谢产物的生物合成基因... 详细信息

链霉菌属于革兰氏阳性细菌,能够合成多种具有生物活性的次级代谢产物,例如抗生素、抗肿瘤物质以及免疫抑制剂等。链霉菌的模式菌株—天蓝色链霉菌的基因组已于2002年完成测序,序列分析表明其基因组中含有多个次级代谢产物的生物合成基因簇,例如放线紫红素、十一烷基灵菌红素、yCPK、芳香苷类化合物的生物合成基因簇。次级代谢产物的生物合成往往会受到双组份信号转导系统(Two-component Signal Transduction Systems,TCSs)的调控。双组份信号转导系统是一种跨膜信号转导系统,典型的双组份信号转导系统由组氨酸蛋白激酶和响应调控蛋白组成。当受到外界环境刺激时,组氨酸蛋白激酶发生自身磷酸化,然后将磷酸基团转移到响应调控蛋白的天冬氨酸上,激活的响应调控蛋白调控下游基因的表达。本文主要对天蓝色链霉菌M145的一对典型双组份信号系统SCO2120/SCO2121进行研究,旨在探讨该双组分信号转导系统对天蓝色链霉菌生理过程的调控作用。本研究首先构建了用于sc02120突变的质粒,通过大肠杆菌与链霉菌之间的接合转移获得了sco2120的缺失突变菌株△ 2120。通过对野生型M145和突变株△2120的比较,我们发现△2120的生长速度和孢子发育明显比野生型菌株慢,而且放线紫红素、十一烷基灵菌红素和钙依赖性抗生素的合成也受到显著抑制。为了验证△ 2120的表型变化是由sco2120的缺失突变引起的,我们进行了 △ 2120的互补实验。将回补质粒转入突变株△ 2120,突变菌株的表型得到了部分恢复,说明突变菌的表型变化是由sco2120的缺失引起的。为了确定SCO2120的靶基因,我们进行了凝胶迁移实验,结果表明,SCO2120能够特异性地结合sco5085(actⅡ-ORF4)的启动子序列,说明SCO2120对放线紫红素的正调控作用可能是通过直接调控actⅡ-orf4实现的。SCO2120也能够与redZd的启动子序列结合,但不结合redD启动子,说明SCO2120可能通过调节redZ实现对十一烷基灵菌红素合成的调控。SCO2120与cdaR的启动子也表现一定的结合活性,提示SCO2120可能直接调控cdaR的表达。此外,本研究选取了部分在野生型和突变菌中表达量差异较大基因的启动子与SCO2120进行了体外结合试验,其中sco0498、sco5320启动子与SCO2120的结合活性最高。DNase I足迹分析表明,SCO2120对sco0498、·sco5320的启动子存在保守结合序列CCGGCGCACCT,推测该序列可能是SCO2120的保守结合位点。为研究SCO2120的体内结合位点,我们构建了能表达SCO2120-His的基因工程菌株△2120/pMS 2120-2,为定位SCO2120的体内结合位点奠定了基础。综合以上结果,双组份信号转导系统SCO2120/SCO2121参与调控天蓝色链霉菌的生长发育及次生代谢产物的生物合成等生理过程,是一个全局性的调控因子。

关键词：双组份信号转导系统天蓝色链霉菌 SCO2120