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PGRN和Rev-erbβ双基因敲除HEK 293细胞系的构建及应用

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生物工程学报 2018年第10期34卷 1679-1692页

作者：陈芳杨沛艳朱久玲安康学院现代农业与生物科技学院陕西安康725000 陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室陕西西安710062

为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA... 详细信息

为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA,经筛选将活性较高的PGRN sgRNA 2和sgRNA 3串联,构建携带双PGRN sgRNA和Cas9的慢病毒打靶载体pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro。再将包装的携带Cas9和双PGRN sgRNA的慢病毒感染HEK293(Rev-erbβ^(-/-))细胞,通过筛选、克隆化及测序分析获得双基因敲除的HEK293 C3-6/23(Rev-erbβ^(-/-);PGRN^(-/-))单克隆细胞系,并用qRT-PCR和Western blotting检测HEK293(C3-6/23)细胞中PGRN mRNA和蛋白质的表达。最后,在双基因敲除HEK293(C3-6/23)细胞系中,通过回补基因方式研究PGRN介导Rev-erbβ对靶基因启动子转录活性调控研究。在PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293(C3-6/23)细胞系中,PGRN基因的两条DNA链均为缺失突变型,PGRN mRNA和蛋白质的表达均未达到检测水平。同时在HEK293(C3-6/23)细胞系中研究发现PGRN与Rev-erbβ相互作用,可以增强Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控。利用CRISPR/Cas9系统,成功构建了双基因敲除的HEK293(Rev-erbβ^(-/-);PGRN^(-/-))C3-6/23单克隆细胞系。利用该敲除细胞系研究发现PGRN可以影响Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控,但PGRN参与介导Rev-erbβ转录调控的机制还有待进一步研究。

关键词： PGRN Rev-erbβ CRISPR/Cas9 双基因敲除慢病毒打靶载体

H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除小鼠的鉴定及繁育

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新疆医科大学学报 2017年第10期40卷 1261-1264页

作者：唐志元王燕吕靓李林格张华新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科乌鲁木齐830054

目的饲养、繁殖和鉴定H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除小鼠,获得双纯合子H2-Eb1^(-/-)+H2-Ab1^(-/-)及双野生型H2-Eb1^(+/+)+H2-Ab1^(+/+)小鼠,为深入研究H2-Eb1、H2-Ab1的基因功能奠定基础。方法基因敲除小鼠经适应性饲养2w后,分别将雌性杂合... 详细信息

目的饲养、繁殖和鉴定H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除小鼠,获得双纯合子H2-Eb1^(-/-)+H2-Ab1^(-/-)及双野生型H2-Eb1^(+/+)+H2-Ab1^(+/+)小鼠,为深入研究H2-Eb1、H2-Ab1的基因功能奠定基础。方法基因敲除小鼠经适应性饲养2w后,分别将雌性杂合子和雄性杂合子小鼠合笼饲养并繁殖,提取鼠尾DNA,利用PCR法鉴定其基因型。生产后代中的野生型和纯合子小鼠用于后续的生物学功能研究,杂合子小鼠用于繁殖及保种。结果小鼠成功繁殖,其中双纯合子H2-Eb1^(-/-)+H2-Ab1^(-/-)20只(20%),双野生型H2-Eb1^(+/+)+H2-Ab1^(+/+)26只(26%),未鉴定出基因型54只(54%)。成功获得H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除纯合子小鼠,并建立了饲养、繁殖和鉴定方法。结论采用雌性和雄性H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除杂合子小鼠交配,不仅可以获H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除纯合子小鼠,而且有利于长期饲养与繁殖。

关键词：双基因敲除小鼠基因鉴定繁育方法

PTA-1^(-/-)/ApoE^(-/-)双基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

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实验动物科学 2012年第5期29卷 6-8页

作者：董子龙庄然张宇丝金伯泉张圆第四军医大学西京医院皮肤科西安710032 第四军医大学免疫学教研室西安710032 第四军医大学生理学教研室西安710032

目的建立(PTA-1-/-/ApoE-/-)双基因敲除小鼠(double-gene knockout,DKO)模型,探讨该小鼠的繁育及鉴定方法,为进一步利用该小鼠研究相关疾病奠定基础。方法将引进的PTA-1-/-及ApoE-/-基因敲除小鼠通过杂交和互交的方法进行繁殖,以得到DK... 详细信息

目的建立(PTA-1-/-/ApoE-/-)双基因敲除小鼠(double-gene knockout,DKO)模型,探讨该小鼠的繁育及鉴定方法,为进一步利用该小鼠研究相关疾病奠定基础。方法将引进的PTA-1-/-及ApoE-/-基因敲除小鼠通过杂交和互交的方法进行繁殖,以得到DKO小鼠。结果经过PCR基因鉴定的方法证实PTA-1-/-/ApoE-/-双基因敲除小鼠繁育成功。结论正确的饲养繁殖及鉴定方法是获得该DKO纯合子小鼠的有效途径。

关键词： PTA-1 ApoE 双基因敲除小鼠

建立载脂蛋白E基因敲除小鼠骨髓髓源性生长因子缺失模型及鉴定

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中国组织工程研究 2022年第14期26卷 2196-2201页

作者：丁燕向光大孟碧莹徐晓丽陈月富湖南医药学院湖南省怀化市418000 中国人民解放军中部战区总医院湖北省武汉市430700

背景:目前关于髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)与动脉粥样硬化及代谢性疾病的研究较少,因此建立一种载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)敲除骨髓MYDGF缺失的小鼠模型对于研究MYDGF与动脉粥样硬化疾病的关系尤为重... 详细信息

背景:目前关于髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)与动脉粥样硬化及代谢性疾病的研究较少,因此建立一种载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)敲除骨髓MYDGF缺失的小鼠模型对于研究MYDGF与动脉粥样硬化疾病的关系尤为重要。目的:建立ApoE敲除骨髓MYDGF特异性缺失小鼠模型并进行鉴定。方法:ApoE敲除小鼠和骨髓特异性MYDGF敲除小鼠,均购于上海南方模式生物科技股份有限公司。选取5只ApoE敲除小鼠与10只骨髓特异性MYDGF敲除小鼠进行交配,得到基因型为MYDGF^(flox)/+ApoE^(flox)/+F1子代小鼠30只,MYDGF^(flox)/+ApoE^(flox)/+互相进行交配,一共得到基因型为MYDGF^(flox)/floxApoE^(flox)/flox双敲除小鼠30只和ApoE^(flox)/flox小鼠子代小鼠34只。采用PCR法进行MYDGF^(flox)及ApoE^(flox)基因型鉴定,记录MYDGF^(flox)/floxApoE^(flox)/flox双敲除小鼠与ApoE^(flox)/flox小鼠2月龄的体长及体质量,采用Western blotting和免疫荧光检测2组小鼠骨髓组织MYDGF蛋白相对表达量,油红O染色检测2组小鼠胸主动脉斑块面积。实验方案经中国人民解放军中部战区总医院动物实验伦理委员会批准。结果与结论:①得到基因型为ApoE^(flox)/flox小鼠共34只、MYDGF^(flox)/floxApoE^(flox)/flox小鼠共30只,2组小鼠体长、体质量比较差异均无显著性意义(均P>0.05);②MYDGF^(flox)/floxApoE^(flox)/flox小鼠骨髓组织MYDGF蛋白相对表达量显著低于ApoE^(flox)/flox小鼠(P敲除了ApoE小鼠的MYDGF基因,说明成功构建ApoE敲除骨髓特异性MYDGF缺失小鼠模型,并经基因型及蛋白组织水平鉴定;MYDGF基因缺乏可以加重ApoE基因敲除小鼠的动脉粥样硬化。

关键词：骨髓细胞 MYDGF基因 ApoE基因 MYDGF蛋白双基因敲除小鼠

FAH/GSTZ1双基因突变肝细胞模型的建立

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中国比较医学杂志 2022年第8期32卷 71-78页

作者：刘艳顾鹏叶行梁春锦关雅今张映辉邹庆剑顾为望五邑大学生物科技与大健康学院广东江门529020 江门市大健康国际创新研究院广东江门592040 华南生物医药大动物模型研究院广东省医学大动物模型重点实验室广东江门529728 南方医科大学实验动物管理中心暨比较医学研究所广州510515

目的采用CRISPR/Cas9技术敲除人LO2肝细胞系的谷胱甘肽S-转移酶Z1(GSTZ1)和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH),探讨GSTZ1和FAH基因敲除对于肝细胞生长、增殖、迁移的影响。方法分别构建靶向GSTZ1和FAH基因的向导RNA(sgRNA)载体,与CRISPR/Cas... 详细信息

目的采用CRISPR/Cas9技术敲除人LO2肝细胞系的谷胱甘肽S-转移酶Z1(GSTZ1)和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH),探讨GSTZ1和FAH基因敲除对于肝细胞生长、增殖、迁移的影响。方法分别构建靶向GSTZ1和FAH基因的向导RNA(sgRNA)载体,与CRISPR/Cas9载体共转染LO2细胞,通过有限稀释法筛选,基因型鉴定和Western blot实验证实获得的FAH和GSTZ1基因的单基因敲除和双基因敲除三种细胞株。进一步对敲除细胞株表型进行鉴定,通过平板克隆形成实验检测基因敲除肝细胞克隆形成能力;CCK8实验和EdU分析实验测试细胞增殖能力;划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功获得GSTZ1、FAH和FAH/GSTZ1三种基因敲除细胞株。相比于野生型细胞,三种细胞株在增殖能力,克隆形成能力、迁移能力均有显著增加,其中FAH敲除对细胞表型的影响相对较小,GSTZ1敲除对肝细胞活性提高最强,双基因敲除细胞活性处于两个单基因敲除之间。结论我们首次成功建立了FAH/GSTZ1双基因突变肝细胞株,为酪氨酸代谢通路研究和Ⅰ型遗传性酪氨酸血症治疗研究提供了一个新型的细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9技术双基因敲除 GSTZ1 FAH LO2细胞系

基于CRISPR/Cas9技术的水稻转录因子tify1a和tify1b突变体的创建与分析

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农业生物技术学报 2017年第6期25卷 1003-1012页

作者：黄小贞曾晓芳李建容赵德刚贵州大学农业生物工程研究院/生命科学学院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室贵州省农业科学院

低温寒害严重影响水稻(Oryza sativa)的生长、发育和产量。为了更好的解析水稻响应低温的分子机制,改良水稻对低温的耐受能力。本实验室前期构建了贵州特有的抗寒粳稻"告公鬼"的低温胁迫响应抑制差减文库,从文库中筛选克隆了一个冷诱导... 详细信息

低温寒害严重影响水稻(Oryza sativa)的生长、发育和产量。为了更好的解析水稻响应低温的分子机制,改良水稻对低温的耐受能力。本实验室前期构建了贵州特有的抗寒粳稻"告公鬼"的低温胁迫响应抑制差减文库,从文库中筛选克隆了一个冷诱导表达的基因LOCOs03g52450。该基因含有保守的TIF[F/Y]XG氨基酸排列形式,编码水稻TIFY转录因子家族中的TIFY1b。本实验利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9)基因组编辑系统,分别构建TIFY1b及其同源基因TIFY1a(LOCOs03g47970)的单基因以及双基因敲除载体。通过农杆菌(Agobacterium tumefaciens)介导的愈伤转化法侵染水稻品种日本晴(Nipponbare),潮霉素抗性筛选之后获得T0代转基因植株。对转基因植株的靶位点进行测序分析发现有纯合,杂合和双等位等多种突变类型。进一步分析氨基酸序列发现突变株系的蛋白质翻译均存在着不同程度的变异。本研究成功实现了水稻转录因子TIFY1家族2个基因,TIFY1a和TIFY1b的单基因和双基因编辑,获得了一系列不同类型的tify1a和tify1b的单基因突变株系以及双基因突变株系,为进一步揭示TIFY1响应水稻低温应答的作用机制提供材料和理论依据,并为利用CRISPR/Cas9技术研究功能冗余的基因家族提供了新思路。

关键词：水稻抗寒 CRISPR/Cas9 TIF[F/Y]XG氨基酸排列形式转录因子双基因敲除

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大肠杆菌中重组蛋白的渗漏表达

大肠杆菌中重组蛋白的渗漏表达

作者：陈昭元安徽大学

学位级别：硕士

为了提高大肠杆菌细胞膜、壁的通透性并使之用于重组蛋白的胞外生产,本研究通过遗传方法构建渗漏菌株,研究胞内的目标蛋白在渗漏表达至胞外的特点。同时研究不同渗漏菌株和不同培养基对重组蛋白胞外生产的影响。在本研究中,使用大肠杆... 详细信息

为了提高大肠杆菌细胞膜、壁的通透性并使之用于重组蛋白的胞外生产,本研究通过遗传方法构建渗漏菌株,研究胞内的目标蛋白在渗漏表达至胞外的特点。同时研究不同渗漏菌株和不同培养基对重组蛋白胞外生产的影响。在本研究中,使用大肠杆菌基因敲除策略构建了大肠杆菌细胞壁合成相关基因mrcA, mrcB, mrcA-TP和mrcB-TP以及细胞外膜合成基因pal和lpp(对照)的单基因突变菌株,然后进一步构建mrcA, mrcB, pal和lpp之间的双基因突变菌株。之后,为了测试这些渗漏菌株的重组蛋白胞外分泌效率,构建了以硫氧还融合蛋白形式表达的人甲状旁腺激素(Trx-hPTH)和以硫氧还融合蛋白形式表达的可溶型B淋巴刺激因子(Trx-sBLyS)的重组菌株。然后,在摇瓶条件下使用基础培养基(MR培养基)和复合培养基(TB培养基),分别进行了这些重组菌株目标蛋白的渗漏发酵实验,之后检测这些菌株的生长特性以及分布于细胞内和细胞外的目标蛋白的产量。最后,根据摇瓶发酵的条件,选用了两种双基因敲除菌株进行5L发酵罐的目标蛋白发酵实验。结果表明,本研究得到的渗漏菌株是遗传稳定的,而且这些菌株的生长周期和出发菌株相比是相似的。在MR培养基中pal单基因敲除菌株可实现220mg/L的Trx-hPTH蛋白胞外渗漏水平,而且mrcA和lpp双基因敲除菌株的88.9%重组蛋白渗漏比率比lpp单基因敲除菌株的71.1%和原始对照菌株的无渗漏要高。在TB培养基中所有的双基因敲除菌株的胞外重组蛋白水平都超过了单基因敲除菌株。在发酵罐中最高的胞外蛋白表达水平达到了680mg/l。

关键词：渗漏菌株胞外生产重组蛋白人甲状旁腺激素双基因敲除

瘦素和载脂蛋白E基因共同缺陷促进糖尿病动脉粥样斑块形成

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中国微循环 2009年第3期13卷 200-203页

作者：陈婷婷胡洪亮同济大学附属第十人民医院急诊内科上海200072 同济大学检验医学部中心实验室上海200072

目的通过瘦素基因缺陷的肥胖型Ⅱ型糖尿病小鼠与ApoE基因敲除(ApoE Knockout)的高胆固醇血症合并动脉粥样硬化的小鼠进行杂交,产生混合性高甘油三酯血症和高胆固醇血症并较单纯ApoE基因敲除小鼠具有更明显的血管动脉粥样硬化。方法采用... 详细信息

目的通过瘦素基因缺陷的肥胖型Ⅱ型糖尿病小鼠与ApoE基因敲除(ApoE Knockout)的高胆固醇血症合并动脉粥样硬化的小鼠进行杂交,产生混合性高甘油三酯血症和高胆固醇血症并较单纯ApoE基因敲除小鼠具有更明显的血管动脉粥样硬化。方法采用杂交、回交、互交的方法进行培育,提取小鼠尾部基因组DNA进行PCR分析和血浆脂质测定,并从大体病理标本上,主动脉纵切面观察比较血管动脉粥样硬化情况。结果通过上述培育方法,成功得到Leptin及ApoE双基因敲除小鼠。成年小鼠表现为极度的混合型高脂血症,其血浆甘油三酯和胆固醇水平是正常小鼠的2.6倍和8.6倍,其主动脉血管粥样硬化斑块较单纯ApoE基因敲除小鼠更为明显。结论成功培育了Leptin/ApoE双基因敲除的遗传性混合型高甘油三酯、高胆固醇血症小鼠并具有更明显的动脉粥样硬化斑块。

关键词：载脂蛋白E 瘦素双基因敲除动脉粥样硬化小鼠模型