检索结果-南通市图书馆

作者：张磊东华大学

学位级别：硕士

一直以来,生物学家们都梦想拥有一种能够随意调控基因特异性表达的技术,CRISPR/Cas Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated system)系统的横空出世大大满足了这种需求,Cas9就像一把魔剪,在sgRNA的引领下,特异性地识别切割目的序列,并形成DNA的双链断裂缺口。近年来,一些科学家通过研究Cas9的结构,然后通过定点突变的方法使Cas9的核酸内切酶的活性失活而获得了dead Cas9(简写为dCas9),dCas只会在sgRNA的引导下特异性的结合到靶标,而不会对DNA产生切割。如果在dCas9上融合一些激活元件的话,就可以特异性地过表达目的基因,从而可以实现调控基因表达的梦想。这种方法相对于传统的过表达具有非常显著的优势;因为它可以不受基因大小的限制,可以非常方便同时上调多个基因表达,而且这种过表达会更加“nature”,可以研究复杂的多蛋白和多基因因素引起的人类疾病。现在由dCas9为基础的载体介导基因激活已经被广泛用于体外研究,但利用dCas9在体内控制特定的目的基因表达还一直没有得到实现。DNA甲基化是向DNA添加甲基的一个后生过程,主要发生在CpG(cytosine phosphodiester guanine)二核苷酸中胞嘧啶碱基的第五个碳上。甲基化可以改变DNA片段活性而不改变其序列。在哺乳动物细胞中,DNA的甲基化可以精密地调控基因的表达,从而在许多生理和病理过程中发挥着关键的作用,其中包括:细胞发育和分化、基因在特定时间的表达沉默、基因组印迹和肿瘤发生等等。因此,开发在体内调控靶基因DNA甲基化状态的技术,不仅有助于我们理解DNA甲基化如何在特定时间和空间下调节基因的表达,而且能主动的操纵基因表达,并可能在临床治疗上有着非常光明的前景。Ten-eleven translocation(Tet)加双氧酶催化的5-甲基胞嘧啶氧化,可促使具有Tet催化结构域(Tet-catalytic domain,Tet-CD)的DNA去甲基化。利用CRISPR-dCas9系统融合Tet-CD蛋白,靶向DNA去甲基化,是我们这个课题的出发点。在这项研究中,我们得到以下结论:(1)首先我们构建了All-in-one vector,它优化了基于dCas9的CRISPR系统,除了在dCas9蛋白后面融合了Tet-CD蛋白以外,还通过核糖体结合位点(IRES)连接了MS2-NLS-Tet-CD蛋白,从而可以更多的表达Tet-CD蛋白,以达到提高靶定DNA去甲基化的效率的目的。同时选取Makorin ring finger 3(Mkrn3)基因的启动子区域作为靶标,在Neuro-2a和胎鼠原代神经元细胞中进行转染dCas9-s gRNA-Tet1CD-IRES-MS2-NLS-Tet-CD质粒,使用使用QPCR技术检测Crispr-dCas9激活系统在Neuro-2a细胞和胎鼠原代神经元中激活M krn3基因的表达情况,我们发现Mkrn3基因表达得到了明显上调,相对于对照组大约增加了2倍。这为以后的实验提供了良好的技术支持。(2)我们进一步以慢病毒载体为基础构建了CRISPR-dCas9激活系统靶定Mkrn3 Promoter的去甲基化,使用QPCR技术检测激活Mkrn3基因的表达情况,我们发现实验组的Mkrn3基因的表达得到了明显的上调,相对于对照组大约增加了4倍。希望该慢病毒系统能够得到更广泛的应用。(3)最后以dCas9-VP64载体为基础构建的Crispr-dCas9激活系统靶定Mkrn3 Promoter去甲基化,使用QPCR技术检测激活Mkrn3基因的表达情况,我们可以得出该系统具有非常高的效率,大约为3倍。与我们之前以慢病毒载体为基础构建的Crispr-dCas9激活系统相比较发现,后者具有更高的效率,大约为4倍,但是都比以Crispr-dCas9载体为基础构建All-in-one vector的激活系统效率要高。我们分析发现可能是由于All-in-one vector载体多达15kb,导致质粒转染效率低的缘故,从而影响了Mkrn3基因表达的检测。未来还将换用腺相关病毒载体(AAV)进一步验证该系统去甲基化的效率,同时我们也将利用该系统融合甲基化酶DNMT3a和DNMT3L,检测该系统甲基化某些基因的效率。由于DNA甲基化与某些人类疾病间的关系紧密,尤其是在癌症中抑癌基因普遍存在被过度甲基化修饰而表达受到抑制或沉默的现象,因而引发肿瘤。如果能够利用我们构建的dCas9去甲基化系统,对多基因同时进行调控,将会加快疾病机理的阐明和药物靶点的开发的进程,也为未来的基因治疗提供潜在的治疗手段。综上所述,由我们开发的这套sgRNA介导的dCas9去甲基化系统未来会在表观遗传学编辑和临床研究中具有非常光明的应

关键词： Crispr dCas9 去甲基化 Mkrn3

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雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因甲基化情况及三氧化二砷去甲基化的研究

雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因甲基化情况及三氧化...

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作者：郑磊大连医科大学

学位级别：硕士

目的：近年来研究发现，DNA甲基化是肿瘤发生发展的重要机制之一。DNA甲基化常发生于抑癌基因启动子区（CpG岛），通过抑制启动子功能使抑癌基因表达沉默，导致肿瘤发生。本实验通过对雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因启动... 详细信息

目的：近年来研究发现，DNA甲基化是肿瘤发生发展的重要机制之一。DNA甲基化常发生于抑癌基因启动子区（CpG岛），通过抑制启动子功能使抑癌基因表达沉默，导致肿瘤发生。本实验通过对雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因启动子甲基化的研究，来探讨SFRP-1启动子甲基化与前列腺癌的关系及三氧化二砷诱导前列腺癌细胞凋亡的机制。方法：通过CCK8方法检测三氧化二砷对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测三氧化二砷对前列腺癌PC-3细胞凋亡的作用;采用亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）检测三氧化二砷处理前后前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因启动子CpG岛甲基化;免疫荧光法检测三氧化二砷处理前后前列腺癌PC-3细胞SFRP-1表达;荧光定量PCR法检测三氧化二砷处理前后前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因mRNA表达情况;Western Blot检测三氧化二砷处理前后前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1蛋白表达情况。结果：CCK8检测发现：三氧化二砷能明显抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖，并呈时间剂量依赖性（P化二砷梯度浓度为（0，1，2.5,5,10,20）μmol／L处理PC-3细胞24h和48h后，流式细胞检测凋亡率分别为：（5.5±0.87，8.8±1.43，15.5±2.72，26.9±1.63，36.7±2.12和55.8±3.87）%;（7.9±1.32，11.2±1.56，25.8±2.84，38.7±3.56，57.2±2.53，70.9±5.04）%，三氧化二砷处理后凋亡明显增加（P甲基化，甲基化程度分别为85%和71%;而加入10μmol／L三氧化二砷作用24小时后，两个CpG岛甲基化程度分别减少到54.2%和69.8%，对第一个CpG岛去甲基化作用明显;免疫荧光结果显示：正常前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1基因表达很少，而应用10μmol／L三氧化二砷作用24小时后，SFRP-1基因的表达显著增加（P化二砷处理后，PC-3细胞中SFRP-1mRNA表达显著性增加，随着三氧化二砷浓度的增加SFRP-1的表达量逐渐增加，有明显差异（P化二砷处理后前列腺癌PC-3细胞中SFRP-1蛋白表达较正常对照组增多，且随着三氧化二砷作用浓度的增加，SFRP-1蛋白表达显著性增加（P甲基化，三氧化二砷对其有去甲基化作用，使SFRP-1基因重新表达。三氧化二砷诱导前列腺癌PC-3凋亡可能与其去甲基化，使其重新表达有关。

关键词：前列腺癌三氧化二砷 CpG岛甲基化去甲基化 SFRP-1

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LSD1介导的组蛋白H3K4去甲基化对雄激素受体调控靶基因转录的影响

LSD1介导的组蛋白H3K4去甲基化对雄激素受体调控靶基因转录的影响

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作者：张聪哲复旦大学

学位级别：硕士

雄激素受体(AR)是一个转录因子,它可以调控其下游靶基因的转录表达过程,并且它在前列腺癌的恶化发展过程中起着重要作用。和雄激素结合后,AR进入细胞核,和染色质上特定的DNA片段一一雄激素反应元件(ARE)结合,发挥其功能。在本论文的研究... 详细信息

雄激素受体(AR)是一个转录因子,它可以调控其下游靶基因的转录表达过程,并且它在前列腺癌的恶化发展过程中起着重要作用。和雄激素结合后,AR进入细胞核,和染色质上特定的DNA片段一一雄激素反应元件(ARE)结合,发挥其功能。在本论文的研究中,我们发现AR和染色质片段的结合引发了赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)介导的组蛋白3的4位赖氨酸的去甲基化过程。去甲基化过程产生了过氧化氢等活性氧组分(ROS),它是一种对细胞生理有害的物质,可以氧化DNA链上较为脆弱的鸟嘌呤成为8氧鸟嘌呤,ROS的产生引起了8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)以及脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(Ape1)等核酸修复通路酶与染色质增强子,启动子区域的结合,来消除活性氧对细胞造成的损伤,确保AR靶基因转录过程的顺利进行。在这个过程中,RNA聚合酶Ⅱ以及拓扑异构酶Ⅱ等辅助蛋白因子和AR, LSD1, Apel,OGG1一起形成转录复合物,参与转录过程。在本论文中,我们使用具有抗氧化剂活性以及氧化酶抑制剂活性的药物对前列腺癌细胞进行处理,实验证明阻碍氧化过程会使得AR靶基因：PSA, TMPRSS2, miR-125b2以及miR-133b的表达量显著下调,这其中,miR-133b是课题组前期通过生物信息学方法预测的AR直接调控的靶基因。用siRNA对LSD1, OGG1和TopoisomeraseⅡ进行干扰,也同样可以抑制上述AR靶基因的转录。通过染色质免疫沉淀实验我们检测到了LSD1, OGG1, Ape1, Topoisomerase Ⅱ和RNAP Ⅱ在受到雄激素刺激后在染色质相关区域结合的增加,在用siRNA对LSD1进行干扰后,检测到了OGG1, Topoisomerase Ⅱ和RNAP Ⅱ结合的减少,说明了AR受到雄激素刺激后发挥功能,招募LSD1到染色质相关区域,而LSD1介导的去甲基化又招募其它蛋白辅助因子到染色质上,共同构成了转录复合物,维持AR靶基因转录的正常进行。考虑到不同辅助蛋白因子可能会结合到染色质的不同增强子区域,而各个增强子之间的距离可能很远,我们认为临时的基因线环这种空间结构的形成促成了转录复合物的形成,同时DNA链的氧化损伤也消除了线环形成的空间阻力,所以基因线环的形成应该是一个伴随DNA氧化损伤/修复的瞬时和动态循环的过程,我们通过染色体结构捕捉实验(3C)检测到了基因线环的形成和消失,验证了这种观点的真实性。总结来说,本论文的实验证明了在雄激素受体调控通路中,LSD1介导的H3K4去甲基化过程产生了活性氧组分,造成了DNA链的损伤;OGG1, Apel等损伤修复酶被招募到染色质特定区域,修复氧化损伤;同时临时的基因线环结构形成来促进包含了AR,LSD1,OGG1,Ape1,Topo Ⅱ和RNAPⅡ等转录因子和蛋白辅助因子的转录复合物的形成,维持AR靶基因转录的正常进行。在整个模型中,AR招募LSD1结合到染色质相关区域,LSD1介导组蛋白去甲基化并生成活性氧组分并招募DNA氧化损伤修复酶。根据这个过程,我们得出结论：去甲基化,DNA氧化损伤,氧化损伤修复,以及基因线环结构的形成对于AR调控的miR-125b2和miR-133b的正常转录都是必不可少的。实验结果也从另一个方面证实了,miR-133b是AR直接调控的靶基因。同时,这些表观遗传方面的实验结论也为AR调控通路的研究提供了新的视角,为前列腺癌的发生恶化以及治疗过程的研究提供了新的思路。

关键词：雄激素受体组蛋白特异性去甲基化酶1 雄激素受体靶微小RNA 去甲基化 DNA氧化损伤/修复基因线环

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LATS1基因去甲基化在人骨肉瘤增殖、凋亡和侵袭中的作用

LATS1基因去甲基化在人骨肉瘤增殖、凋亡和侵袭中的作用

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作者：武太勇山西医科大学

学位级别：硕士

目的:探究LATS1基因在骨肉瘤中发挥的作用,利用去甲基化药物使LATS1基因的表达增高,从而研究其对人骨肉瘤细胞功能的影响。方法:(1)免疫组织化学染色检测人骨肉瘤组织和正常骨组织中的大肿瘤抑制基因-1(Large Tumor Suppressor gene 1,L... 详细信息

目的:探究LATS1基因在骨肉瘤中发挥的作用,利用去甲基化药物使LATS1基因的表达增高,从而研究其对人骨肉瘤细胞功能的影响。方法:(1)免疫组织化学染色检测人骨肉瘤组织和正常骨组织中的大肿瘤抑制基因-1(Large Tumor Suppressor gene 1,LATS1)基因的表达差异情况。采用q RT-PCR检测人骨肉瘤组织、正常骨组织和成骨细胞(Hfob1.19)、人骨肉瘤细胞系(Saos2、U2)中m RNA水平的表达差异。使用蛋白免疫印迹法(Western-Blot)检测成骨细胞(Hfob1.19)、人骨肉瘤细胞系(Saos2、U2)蛋白水平的表达差异。(2)应用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)检测人骨肉瘤细胞系(Saos2和U2)中LATS1的甲基化状态,利用5-氮杂-2脱氧胞苷(5-Aza-2′Deoxycytidine,DAC)去甲基处理Saos2细胞和U2细胞。分别设置对照组、溶剂组和实验组。应用q RT-PCR检测各组细胞中LATS1的m RNA表达,利用Western-Blot检测各组细胞中LATS1的蛋白表达。检测药物处理后各组细胞中LATS1对骨肉瘤细胞增殖(RTCA)、凋亡(流式细胞术)和侵袭(Transwell)等生物学特性的影响。结果:(1)免疫组化结果显示:LATS1呈胞质表达,骨组织中的表达量高于骨肉瘤组织(P甲基化。q RT-PCR结果显示,LATS1在Aza-Saos2组中表达量高(P甲基化程度较高。(3)给予去甲基化药物处理后能够显著上调LATS1基因m RNA和蛋白水平。(4)LATS1基因能够抑制Saos2和U2细胞的增殖能力,诱导其发生凋亡,阻止其发生侵袭。

关键词：骨肉瘤 LATS1 去甲基化侵袭凋亡

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LATS1基因去甲基化对人肾癌细胞生物学功能及其Hippo-YAP信号通路的影响

LATS1基因去甲基化对人肾癌细胞生物学功能及其Hippo-YAP信号通路...

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作者：陈柯宏重庆医科大学

学位级别：硕士

目的探讨LATS1基因去甲基化对人肾癌细胞生物学功能及其Hippo-YAP信号通路的影响。方法利用RT-PCR检测人透明细胞肾癌细胞系786-O和人胚肾细胞系HEK-293中Hippo-YAP信号通路大肿瘤抑制基因-1（Largetumor suppressor gene1, LATS1）mRN... 详细信息

目的探讨LATS1基因去甲基化对人肾癌细胞生物学功能及其Hippo-YAP信号通路的影响。方法利用RT-PCR检测人透明细胞肾癌细胞系786-O和人胚肾细胞系HEK-293中Hippo-YAP信号通路大肿瘤抑制基因-1（Largetumor suppressor gene1, LATS1）mRNA和下游癌基因Yes-相关蛋白（Yes-associated protein, YAP）mRNA表达水平，用亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequence-PCR, BSP)对LATS1低表达细胞786-O进行甲基化分析，5-氮杂-2脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine, DAC)处理786-O和HEK-293后，用RT-PCR和Western Blot检测各组细胞LATS1和YAP的mRNA和蛋白表达水平，流式细胞术（Flow cytometry, FCM）检测各组细胞凋亡和周期，细胞增殖/毒性试剂（Cell counting kit-8, CCK-8）检测各组细胞增殖抑制情况。结果786-O较HEK-293LATS1mRNA表达水平显著降低（P甲基化;DAC处理786-O后，LATS1mRNA和蛋1基金项目：国家自然科学基金面上项目（30972999）白表达水平显著升高（P化（P>0.05）。结论LATS1基因去甲基化后下调YAP基因表达，抑制786-O细胞增殖并诱导其凋亡。LATS1基因甲基化可能在肾癌发生中起重要作用。

关键词：肾细胞癌去甲基化 Hippo-YAP LATS1 YAP

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健脾补肾活血解毒方联合地西他滨治疗骨髓增生异常综合征的多中心随机对照研究

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中医肿瘤学杂志 2024年第2期6卷 17-23页

作者：任建业陆嘉惠施艳曾庆陶雨晨上海中医药大学附属市中医医院上海200071 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院上海200437

目的观察健脾补肾活血解毒方联合地西他滨(Decitabine,DAC)治疗骨髓增生异常综合征的临床疗效及安全性。方法收集2017年1月至2019年9月在上海中医药大学附属市中医医院、上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院、上海交通大学医学院附属... 详细信息

目的观察健脾补肾活血解毒方联合地西他滨(Decitabine,DAC)治疗骨髓增生异常综合征的临床疗效及安全性。方法收集2017年1月至2019年9月在上海中医药大学附属市中医医院、上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院、上海交通大学医学院附属瑞金医院北院、上海交通大学医学院附属第九人民医院诊断为骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)患者120例,使用中心分层随机化方法,对满足DAC治疗要求的各危度MDS患者根据随机数字表进入西医组和中西医结合组,各60例。两组均给予相同的西医标准治疗,中西医结合组加以健脾补肾活血解毒方辨证加减治疗,比较两组患者西医、中西医结合的疗效及不良反应情况。结果本研究共收集120例,完成研究97例,其中西医组44例,中西医结合组53例。两组未出现完全缓解和部分缓解患者,西医疗效方面,西医组总有效率为25.0%,中西医结合组总有效率47.2%,中西医结合组总有效率高于西医组(P0.05)。结论健脾补肾活血解毒方联合DAC治疗方案在总有效率及生活质量等方面优于单纯应用DAC,且对于MDS患者中医症状改善更为明显。

关键词：骨髓增生异常综合征健脾补肾活血解毒方去甲基化多中心随机对照

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5-氮杂-2'-脱氧胞苷对肺癌SPC-A-1细胞RAR-β基因去甲基化及其表达的作用

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广东医学 2016年第15期37卷 2234-2237页

作者：李琪刘莉敏杨玉梅谢艳丽李玉磊武汉科技大学附属天佑医院呼吸内科武汉430064

目的观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肺腺癌SPC-A-1细胞视黄酸受体β(RAR-β)基因甲基化状态的影响,探讨不同浓度5-Aza-CdR对RAR-β基因表达缺陷的调控机制。方法将体外培养的人肺腺癌SPC-A-1细胞株分为4组,分别是A组(未加药)及B、... 详细信息

目的观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肺腺癌SPC-A-1细胞视黄酸受体β(RAR-β)基因甲基化状态的影响,探讨不同浓度5-Aza-CdR对RAR-β基因表达缺陷的调控机制。方法将体外培养的人肺腺癌SPC-A-1细胞株分为4组,分别是A组(未加药)及B、C、D组(分别加入3、6、12μmol/L的5-Aza-CdR)。采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测4组细胞RAR-β基因甲基化状态的差异,RT-PCR法检测4组细胞RAR-βmRNA表达水平的差异,Western blot检测4组细胞RAR-β蛋白表达水平的差异,流式细胞仪技术检测各组细胞周期及细胞凋亡率的差异。结果 A组标本检测出RAR-β基因为甲基化状态,而B、C、D组均检测出RAR-β为去甲基化状态。肺腺癌SPC-A-1细胞RAR-βmRNA及RAR-β蛋白表达水平低下,经5-Aza-CdR处理后,其表达水平明显增强(P甲基化出现表达缺陷,5-Aza-CdR具有明显去甲基化作用,可诱导RAR-β基因重新激活表达,促进肺癌细胞凋亡及抑制癌细胞增殖,从而发挥抗癌作用。

关键词： 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 RAR-β基因去甲基化肺肿瘤

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污染水产去甲基化表观遗传毒性EGFP评价方法

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中国科学：化学 2011年第9期41卷 1548-1554页

作者：王先良满江红王春辉江艳王小利杨怡姝王菲菲赵秀阁李琴段小丽张衍燊张金良环境基准与风险评估国家重点实验室中国环境科学研究院北京100012 安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生系合肥230032 厦门大学海洋与环境学院厦门361005 北京工业大学生命科学与生物工程学院北京100124

pEGFP-C3质粒经过体外人工甲基化处理后,被转染进入HepG2细胞以构建重组细胞株.以5-AZA为阳性去甲基化毒物与重组细胞共培养,通过亚硫酸氢钠测序法定量检测EGFP基因启动子区甲基化状态,通过实时定量PCR检测EGFP基因表达,借助流式细胞术... 详细信息

pEGFP-C3质粒经过体外人工甲基化处理后,被转染进入HepG2细胞以构建重组细胞株.以5-AZA为阳性去甲基化毒物与重组细胞共培养,通过亚硫酸氢钠测序法定量检测EGFP基因启动子区甲基化状态,通过实时定量PCR检测EGFP基因表达,借助流式细胞术和荧光摄片定量检测共培养细胞的绿色荧光强度,在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表达、GFP蛋白等多个层次研究5-AZA染毒处理与其去甲基化能力和荧光表达改变的响应关系.对天津污染水产的去甲基化能力进行了实际样品测试.结果表明,5-AZA与重组细胞的DNA甲基化、基因表达、蛋白产物变化之间存在显著关联,具有较低的检出浓度和良好的重复性.天津污染海域的水产去甲基化能力较强.本文初步建立了一种污染物去甲基化表观遗传毒性评价方法.

关键词：去甲基化表观遗传毒性评价载体 EGFP 污染物

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胃癌组织中MAGE-1基因启动子B'B区去甲基化状态研究

胃癌组织中MAGE-1基因启动子B'B区去甲基化状态研究

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作者：许琳青岛大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤的治疗是当前非常令人关注的问题，1985年，美国国家癌症研究委员会正式将肿瘤的生物疗法确立为继手术、放疗、化疗后的第四种疗法，肿瘤细胞的抗原性和诱导机体产生针对肿瘤抗原特异性免疫应答的能力是肿瘤免疫治疗的基础。目... 详细信息

恶性肿瘤的治疗是当前非常令人关注的问题，1985年，美国国家癌症研究委员会正式将肿瘤的生物疗法确立为继手术、放疗、化疗后的第四种疗法，肿瘤细胞的抗原性和诱导机体产生针对肿瘤抗原特异性免疫应答的能力是肿瘤免疫治疗的基础。目前肿瘤免疫治疗集中于5个部分：肿瘤疫苗、基因治疗、生物制剂和免疫刺激性化学制剂的使用、过继性细胞免疫及免疫导向治疗。编码黑色素瘤相关抗原的黑色素瘤抗原基因-1(MAGE-1)作为沉默肿瘤相关基因，在正常细胞不表达，但具有在肿瘤细胞中可转录并翻译出功能性产物而促进肿瘤演进的特点。该肿瘤抗原可被肿瘤患者T细胞识别，而成为一种十分有效的免疫系统攻击目标，诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，阻止肿瘤的生长扩散和复发。胃癌作为最常见的消化道恶性肿瘤，其治疗是当前肿瘤免疫学治疗研究的热点。本研究取胃癌组织标本40例及同患者相应的癌旁组织40例作为对照，采用甲基化敏感性内切酶酶切及PCR技术，探讨胃癌组织中MAGE-1基因启动子B′B区去甲基化状态及其与病理分级和临床分期的关系。40例胃癌组织标本中MAGE-1基因启动子B′B区发生去甲基化的标本数为10例，发生率为25％(10／40)，而相应癌旁组织中的发生率为0，两者的差别具有显著的统计学意义(X＝9.257，X0.01(1))＝6.635，P＜0.01)。在低分化腺癌中MAGE-1基因B′B区的去甲化发生率为50％(6／12)，中分化腺癌中发生率为18.7％(3／16)，高分化腺癌中发生率为8.3(1／11)。三者之间两两比较其发生率的差异有统计学意义(卡方值为3.97，P＝0.038＜0.05)。在临床分期中早期胃癌和晚期胃癌组织B′B区的去甲基化发生率分别为16.7％和28.6％，经Fisher精确检验示P＝0.012＜0.05，两者差别有统计学意义。本研究提示胃癌组织中MAGE-1基因启动子的B′B区存在去甲基化现象。该区的去甲基化发生率与胃癌组织的病理分级以及与临床分期有关。

关键词：胃癌 MAGE-1基因启动子去甲基化病理分级临床分期

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恶性淋巴瘤p73基因甲基化及去甲基化研究

恶性淋巴瘤p73基因甲基化及去甲基化研究

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作者：肖华伍中南大学

学位级别：硕士

目的:恶性淋巴瘤(ML)是严重影响人类健康进而威胁人类生命的一种血液系统恶性肿瘤。目前关于恶性淋巴瘤发病机制尚未完全明了,其治疗方法主要为联合化疗。由于化疗对骨髓及其它脏器具有严重的毒副作用,因而影响患者的生活质量并限制临... 详细信息

目的:恶性淋巴瘤(ML)是严重影响人类健康进而威胁人类生命的一种血液系统恶性肿瘤。目前关于恶性淋巴瘤发病机制尚未完全明了,其治疗方法主要为联合化疗。由于化疗对骨髓及其它脏器具有严重的毒副作用,因而影响患者的生活质量并限制临床治疗效果。本实验的目的在于探讨恶性淋巴瘤的部分发病机制,尤其是抑癌基因(p73基因)CpG岛甲基化在恶性淋巴瘤发生发展中的作用及其在指导治疗中的意义。进一步研究5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶(5-aza-2‘deoxycytidine,5-aza-CdR)能否通过逆转甲基化,恢复P73基因表达而发挥抗肿瘤作用,为临床去甲基化治疗奠定基础。方法和结果:首先用酚-氯仿方法提取非霍奇金淋巴瘤细胞的基因组DNA,经热变性法获得单链DNA后用亚硫酸氢钠(NaHSO)硫化处理,然后采用甲基化特异性PCR(Methylation Specific PolymeraseChain Reaction,MSP)方法检测非霍奇金淋巴瘤p73基因CpG岛甲基化状态,琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。P73基因CpG岛甲基化者可见到一条67bP的PCR产物,而非甲基化者则可见到一条72bP的PCR产物。22例非霍奇金淋巴瘤患者MSP检测结果:P73基因CPG岛甲基化率为27.2%。出现甲基化阳性条带的样本,大多数同时伴有非甲基化条带。高度恶性比低度恶性更易发生甲基化,其发生率分别为42.8%和0%。统计学显示有显著性差异(P＜0.05)。为了研究CdR是否具有逆转淋巴瘤细胞P73基因CpG岛高甲基化的作用,我们使用反转录PCR(Reverse transoription Polymerase ChainReaction,RT-PCR)的方法检测CdR药物作用前后P73基因mRNA的表达情况。首先用Tri201提取总RNA,然后经反转录合成cDNA,进一步以cDNA为模板,设计跨越p73基因两个外显子的引物进行35个循环的PCR扩增。P73基因有表达者可见到一条390bp的扩增产物。我们对CdR作用前后淋巴瘤细胞p73基因mRNA的表达情况显示:淋巴瘤细胞的P73基因CpG岛为高甲基化状态,电泳结果未检测到390bp的p73基因mRNA扩增条带;淋巴瘤细胞经CdR作用后电泳显示一条390bp的阳性扩增条带。结论:通过以上实验证明在非霍奇金淋巴瘤中p73基因确有较高频率的CPG岛异常甲基化。RT-PCR结果显示CdR具有明确的去甲基化作用,能够使P73基因重新恢复表达,为非霍奇金淋巴瘤去甲基化临床治疗提供实验依据。

关键词： p73基因甲基化去甲基化 MSP RT-PCR

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