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去泛素化修饰在病毒侵染中的作用研究进展

农业生物技术学报 2022年第10期30卷 2025-2035页

作者：赵添羽韩成贵中国生物技术发展中心中国农业大学植物保护学院

去泛素化修饰是泛素化修饰的逆进程，通过去泛素化酶(deubiquitinase, DUB)去除底物的泛素化修饰，进而调控各种生命进程。近年来，越来越多的报道表明去泛素化修饰能够调控病毒的侵染。本文从DUB的类型、作用特点、在体内的调控作用和... 详细信息

去泛素化修饰是泛素化修饰的逆进程，通过去泛素化酶(deubiquitinase, DUB)去除底物的泛素化修饰，进而调控各种生命进程。近年来，越来越多的报道表明去泛素化修饰能够调控病毒的侵染。本文从DUB的类型、作用特点、在体内的调控作用和在病毒侵染中的作用四个方面，综述了当前关于去泛素化修饰在植物病毒和动物病毒侵染中作用的研究进展，并就进一步深入研究去泛素化修饰在病毒侵染中的作用提出了对策建议。

关键词：去泛素化修饰去泛素化酶(DUB) 病毒侵染调控作用

去泛素化修饰对上皮细胞来源的白介素-33结合IL13基因的调控

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去泛素化修饰对上皮细胞来源的白介素-33结合IL13基因的调控

作者：陶连琴上海交通大学

学位级别：硕士

白介素-33（IL-33）是白介素-1（IL-1）细胞因子家族的新成员,与IL-1α一样都具有双重功能。即一方面可以作为细胞因子被分泌至细胞外,通过配体受体结合的方式发挥作用（IL-33/ST2经典途径）;另一方面可以作为核因子在细胞核内发挥调节... 详细信息

白介素-33（IL-33）是白介素-1（IL-1）细胞因子家族的新成员,与IL-1α一样都具有双重功能。即一方面可以作为细胞因子被分泌至细胞外,通过配体受体结合的方式发挥作用（IL-33/ST2经典途径）;另一方面可以作为核因子在细胞核内发挥调节基因转录的作用（核因子途径）,但具体作用及其机制不甚清楚。有研究发现,IL-33在细胞核内通过与p65形成转录复合体或直接结合p65的启动子区来参与炎症反应的调控。IL-33在支气管哮喘发生发展中发挥重要作用,启动并维持Th2炎症反应,但其核因子功能是否参与哮喘气道炎症的调控尚不清楚。基于IL-33核因子作用的重要性,本课题旨在深入探讨IL-33具体的核因子功能,主要是研究IL-33对其下游靶基因的转录调控。近年来研究发现泛素/去泛素化修饰对基因转录的调控也发挥重要作用,因此本课题拟探究泛素/去泛素化修饰对IL-33核因子功能的调控。通过PEI（聚乙烯亚胺）转染的方式在HEK293T细胞（人胚肾上皮细胞系）中过表达带His标签的泛素（His-ubiquitin）和Flag标签的IL-33（Flag-IL-33）,进一步运用Ni-NTA镍螯合树脂纯化这一方法检测IL-33的泛素化修饰,结果发现IL-33确实存在泛素化修饰;同时,Myc-IL-33和Flag-ubiquitin转染HEK293T细胞,免疫共沉淀发现IL-33与泛素存在相互作用;在HEK293T细胞中过表达Flag-IL-33和多个Myc标签的去泛素化酶（DUB,主要为USP家族）,运用免疫共沉淀的方法筛选IL-33的去泛素化酶,结果发现去泛素化酶USP17和USP21（泛素特异蛋白酶17和21）都能与IL-33相互作用;体外过表达IL-33、USP17和USP21,通过核质分离和免疫荧光实验检测三者的亚细胞定位,结果发现三者共定位于细胞质和细胞核;通过Ni-NTA镍螯合树脂纯化检测USP17和USP21对IL-33泛素化修饰的影响,结果发现USP17和USP21都能介导IL-33的去泛素化,它们的酶活突变体USP17 C89S和USP21C221A去泛素化IL-33的能力下降,而且USP17对IL-33的去泛素化能力更为显著;进一步实验发现,USP17能针对泛素第48位和63位赖氨酸相关的泛素化来介导IL-33的去泛素化;在HEK293T细胞中过表达Flag-IL-33和Myc-USP17或Myc-USP17C89S,使用CHX（环己酰亚胺）处理不同时间（0h、4h、8h、12h）,通过免疫印迹检测IL-33的蛋白水平,结果发现USP17能稳定IL-33的蛋白水平,而USP17酶活突变体C89S不能有效稳定IL-33的蛋白水平;同样地,USP21也能稳定IL-33的蛋白水平。在TAP-IL-33稳转株细胞中,通过实时荧光定量PCR的方法探索IL-33的下游靶点,结果发现IL-13的m RNA水平升高;比对不同种属（人、家鼠、狗、牛）的IL13基因组序列,发现在IL13翻译起始点前有一段约300bp大小的同源非编码序列（CNS）,进一步运用染色质免疫共沉淀的方法检测IL-33是否会结合这段序列,结果发现IL-33能直接结合IL13基因座位上的CNS,而且USP17能下调IL-33对IL13CNS的结合,USP17酶活突变体恰能在逆转这一下调。总之,我们的研究发现了IL-33作为核因子的一个新的下游靶基因,即IL-33能结合IL13基因座位上的CNS,并促进其转录;去泛素化酶USP17和USP21能对IL-33进行去泛素化修饰,这种修饰不仅影响IL-33的稳定性,还能调控IL-33对IL13 CNS的结合,即调控IL-33的核因子功能。IL-13是支气管哮喘发生发展所必需的的细胞因子,我们的研究表明IL-33可直接调控IL-13,这一发现为哮喘免疫学发病机制提供了理论创新,同时拓展了人们对IL-33核因子功能和泛素/去泛素化修饰调控基因转录的认识。

关键词：支气管哮喘白介素-33 去泛素化修饰核因子白介素-13

去泛素化酶USP7在乙型肝炎患者血清中的动态变化及抗炎作用研究

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去泛素化酶USP7在乙型肝炎患者血清中的动态变化及抗炎作用研究

作者：马玉华北理工大学

学位级别：硕士

目的通过人群研究和细胞学实验,探讨去泛素化酶USP7在乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B）中的动态变化及抗炎作用机制。以期为乙型病毒性肝炎的治疗和二级预防提供理论基础。方法研究从人群和细胞两个层面进行探究。1人群研究:选... 详细信息

目的通过人群研究和细胞学实验,探讨去泛素化酶USP7在乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B）中的动态变化及抗炎作用机制。以期为乙型病毒性肝炎的治疗和二级预防提供理论基础。方法研究从人群和细胞两个层面进行探究。1人群研究:选取2018年8月～2018年12月于石家庄市第五医院被诊断为乙型肝炎的初治住院患者的临床基本资料及血标本。根据纳入排除标准,筛选乙型病毒性肝炎初治患者98例。分别采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法和酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中USP7、NF-κB p65、IL-6及TNF-αmRNA及蛋白表达水平。2细胞学实验:将Hep G2.2.15细胞分为6组,分别为空白对照组（control组）,单纯转染组（siRNA-USP7组）,阴性对照组（siRNA-NC组）,恩替卡韦干预组（ETV组）,恩替卡韦联合转染组（ETV+siRNA-USP7组）,恩替卡韦干预阴性对照组（ETV+siRNA-NC组）。首先,确定Hep G2.2.15细胞是否可稳定转染乙型肝炎病毒,此株细胞作为乙型病毒性肝炎功能研究的体外细胞模型是否成立。其次,用CCK8法确定最佳药物作用浓度、处理时间;检测各组的USP7 mRNA和蛋白,确定siRNA序列。最后,用酶标仪法测定谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量;实时荧光定量PCR（RT-PCR）法测定USP7、NF-κB p65、IL-6及TNF-αmRNA表达水平;Western blot法和ELISA法检测上述蛋白含量;免疫沉淀法检测USP7与NF-κB p65的相互作用。3统计学分析:用SPSS22.0统计分析软件对数据进行处理。各指标进行正态性检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。非正态分布计量资料用中位数[四分位间距]描述,非参检验（KW检验）计算组间差异。各指标间相关性分析采用spearman相关分析。计量资料用均数±标准差表示,多组间指标比较采用单因素方差分析。结果1人群研究:乙型病毒性肝炎患者血清中USP7、NF-κB p65、IL-6及TNF-α的表达水平均随着治疗周期的延长而降低（均P＜0.05）。USP7与肝功能指标ALT、AST,炎症指标NF-κB p65、IL-6及TNF-α均呈正相关。2细胞学实验:与Hep G2相比,Hep G2.2.15的HBV-DNA表达量是Hep G2的19862倍,Hep G2.2.15作为乙型病毒性肝炎的体外功能机制研究模型成立。依据CCK8法确定恩替卡韦药浓度为25μg/m L;与control组相比,siRNA-USP7组ALT、AST表达水平均降低、同时,ETV组的ALT、AST表达水平也降低;与ETV组相比,联用USP7-siRNA后ALT、AST表达水平均降低,提示肝损伤减轻（P＜0.05）。与control组相比,siRNA-USP7组USP7 mRNA表达较低（P＜0.05）,相应的NF-κB p65、IL-6及TNF-α的mRNA表达水平也随之降低（P＜0.05）,提示敲减USP7后细胞炎症损伤减轻。与ETV组相比,联用USP7-siRNA后,USP7 mRNA表达较ETV组降低（P＜0.05）,相应的NF-κB p65、IL-6及TNF-α的mRNA表达水平也随之降低（P＜0.05）,提示在给药的基础上抑制USP7可以更好的降低乙型肝炎病毒导致的肝损伤;USP7、NF-κB p65、IL-6及TNF-α蛋白结果与mRNA表达情况趋于一致。对48 h组USP7与NF-κB p65相互作用的检测发现,USP7与NF-κB p65确实发生互作。提示USP7可能通过对NF-κB p65发挥去泛素化作用从而加重乙型病毒性肝炎的肝脏炎性损伤程度,而抑制USP7可有效减轻乙型病毒性肝炎肝脏的炎症损伤。结论1去泛素化酶USP7在乙肝患者血清中呈现高表达,且随着乙肝患者治疗周期的延长呈下降趋势。2去泛素化酶USP7与肝功指标ALT、AST、炎症调节因子NF-κB p65与炎症因子TNF-α、IL-6呈正相关。3去泛素化酶USP7与NF-κB p65相互作用,对NF-κB p65发挥去泛素化作用加重乙型病毒性肝炎肝脏炎性损伤,抑制USP7后,其与NF-κB p65的相互作用降低,NF-κB p65降解,下游炎症因子表达水平也随降低,使得乙型病毒性肝炎肝脏炎性损伤减轻。图22幅;表12个;参129篇。

关键词：乙型病毒性肝炎炎症去泛素化修饰 USP7

去泛素化酶CYLD调控Hippo信号通路的分子机制

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去泛素化酶CYLD调控Hippo信号通路的分子机制

作者：王龙珠安徽医科大学

学位级别：硕士

布鲁克斯皮格勒综合征（Brooke-Spiegler syndrome,BSS）是一种罕见疾病,是病变发生在皮肤及皮肤附属器上的综合征,大多数病人在成年初期开始长出肿瘤,多见于头颈部。这种综合征通常可以发展成肿瘤,比较常见的有螺旋腺瘤、多发性毛发上... 详细信息

布鲁克斯皮格勒综合征（Brooke-Spiegler syndrome,BSS）是一种罕见疾病,是病变发生在皮肤及皮肤附属器上的综合征,大多数病人在成年初期开始长出肿瘤,多见于头颈部。这种综合征通常可以发展成肿瘤,比较常见的有螺旋腺瘤、多发性毛发上皮瘤以及圆柱瘤,这些肿瘤通常是良性的,但是肿瘤会随着时间越长越大,越长越多,从而导致毁容并影响五官的功能。目前已有报导明确指出圆柱瘤基因（cylindromatosis,CYLD）的突变会导致圆柱瘤等皮肤附属器肿瘤的发生,但其具体调控分子机制仍缺乏深入研究和明确报道。CYLD基因是一种肿瘤抑制因子,该基因缺失或突变将会导致圆柱瘤的发生,同时在其他肿瘤如肝癌,乳腺癌,宫颈癌中也发现了CYLD低表达现象。该基因编码的蛋白CYLD是USP家族（ubiquitin-specific proteases,泛素特异性蛋白酶）成员,具有去泛素化酶活性。CYLD可以与底物蛋白发生相互作用并进行识别,切除识别的底物蛋白上通过63位赖氨酸（K63）连接的泛素链,调控底物蛋白的功能,从而调控多条信号通路,如NF-?B（Nuclear factor-κB）、JNK（c-Jun N-terminal kinase）、Wnt（Wingless-INT）等信号通路。去泛素化酶CYLD对底物蛋白的去泛素化修饰是依赖于其与底物的相互作用,因此我们推测CYLD发生点突变或截短突变后,导致某些相互作用的得到或者失去从而导致肿瘤的发生。邻近蛋白标记技术（Proximity-dependent biotin identification,Bio ID）是最近发展起来的一种方法,它可以识别活细胞中目的蛋白质邻近的蛋白质。目的蛋白与生物素（Biotin）连接酶Bir A*突变体进行融合形成融合蛋白,Bir A*能够非特异性地生物素化其10 nm范围内邻近的蛋白质。这些邻近的蛋白可以直接或间接地与融合蛋白相互作用,或者位于相同的亚细胞邻近区域。链霉亲和素与生物素具有极强的亲和力,生物素化修饰的蛋白质可以通过与链霉亲和素结合从细胞提取物中纯化,最后通过质谱法鉴定。本研究中,我们首先验证Bir A*融合的CYLD蛋白的定位和功能与CYLD蛋白有没有差异,发现Bir A*-CYLD融合蛋白与CYLD蛋白相比,亚细胞定位没有发生变化,但去泛素化功能会受到影响。然后我们利用Bio ID技术鉴定野生型、酶活突变型、截短突变体（1-471 a.a）的CYLD蛋白的邻近蛋白,质谱鉴定发现点突变和截短突变后可以获得更多的相互作用,尤其截短突变后获得相互作用显著增加。对截短突变体（1-471 a.a）的CYLD差异互作蛋白进行定位和功能分析发现截短突变体（1-471a.a）的CYLD差异互作蛋白的定位与该截短体的定位是一致的,而对这些相互作用分子的功能分析中,除了已知功能,还发现了一个新的功能:与Hippo信号通路相关。在这些Hippo通路相关分子中,我们筛选出了三个Hippo信号通路的分子:YAP（yes associated protein,yes相关蛋白）、LIMD1（LIM domain-containing protein 1,LIM结构域蛋白1）、AMOT（angiomotin,血管生成抑制素结合蛋白）。随后,我们对这三个分子进行相互作用验证,发现CYLD蛋白只与LIMD1发生相互作用,并对LIMD1进行去泛素化修饰。Hippo通路主要功能是控制组织器官大小、调节细胞增殖、凋亡。该通路包括一系列激酶级联反应、转录辅激活因子和转录因子。转录辅激活因子YAP的活性受到上游激酶级联反应的控制。当Hippo通路被激活时,级联激酶反应被激活,YAP蛋白发生磷酸化,磷酸化的YAP（p YAP）被滞留在细胞质中,一部分被泛素化修饰而发生降解。而当Hippo通路失活后,YAP不能被磷酸化,进而进入到细胞核内,与核内TEAD（Transcription enhancer factor,转录增强因子）家族成员结合后启动促进细胞增殖和生长的基因表达。而AMOT和LIMD1是Hippo通路的上游调控分子,根据报导LIMD1可以负调控Hippo通路,我们通过实验发现过表达LIMD1可以抑制YAP蛋白127位丝氨酸发生磷酸化。有文献报道在果蝇中,CYLD在细胞质中与Hippo通路中的激酶结合而共定位,并通过限制该激酶的磷酸化来降低其活性,从而增加Hippo通路下游关键效应蛋白Yki/YAP在核内积累,促进细胞增殖。所以我们推测CYLD可能通过其去泛素化酶的功能来调控Hippo通路的活性,从而抑制肿瘤的发生。本研究中,我们发现在HEK293（人胚胎肾细胞293）细胞中,过表达CYLD对YAP磷酸化水平以及核定位没有明显影响,但敲低CYLD会使YAP的磷酸化水平下降,细胞核定位增多,同时YAP下游靶基因水平上升,说明敲低CYLD会导致Hippo信号通路活性下降。总

关键词： CYLD Hippo BioID 相互作用去泛素化修饰

泛素特异性蛋白酶7对乙肝细胞中凋亡因子的调控作用研究

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中国临床药理学杂志 2022年第10期38卷 1078-1082页

作者：王雪马玉杨璐铭王林裴盛斐章广玲冯福民华北理工大学公共卫生学院河北唐山063210 华北理工大学临床医学院河北唐山063210 华北理工大学生命科学学院河北唐山063210

目的研究泛素特异性蛋白酶7(USP7)在肝细胞中对凋亡因子的调控作用。方法将HepG2.2.15细胞随机分为3组:对照组,转染组和阴性对照组。对照组为常规培养的细胞;转染组转染si-USP7,阴性对照组使用10%siRNA-mate转染试剂进行处理,各组均处理... 详细信息

目的研究泛素特异性蛋白酶7(USP7)在肝细胞中对凋亡因子的调控作用。方法将HepG2.2.15细胞随机分为3组:对照组,转染组和阴性对照组。对照组为常规培养的细胞;转染组转染si-USP7,阴性对照组使用10%siRNA-mate转染试剂进行处理,各组均处理72 h。实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)检测USP7、P53、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测USP7、P53蛋白的表达情况;酶联免疫法检测谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乙型肝炎病毒(HBV)DNA、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎核心e抗原(HBeAg)的表达量。结果对照组、转染组、阴性对照组USP7 mRNA表达水平分别为1.74±0.01,1.00±0.06和1.73±0.01;P53 mRNA表达水平分别为1.94±0.01,0.81±0.03和1.92±0.01;Bax mRNA表达水平分别为6.28±0.04,1.81±0.16,6.26±0.04;蛋白结果的趋势与基因一致。以上3组的HBV-DNA表达量分别为(1032.68±2.96),(541.92±6.78)和(1035.44±1.86)pg·mL^(-1);HBsAg表达量分别为(905.19±1.41),(246.23±7.04)和(902.56±4.74)U·mL^(-1);HBeAg表达量分别为(45.28±0.06),(10.09±0.68)和(45.82±0.36)U·mL^(-1)。以上指标,转染组与对照组比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论USP7的下调能减少P53的表达,使Bax表达下降,并降低乙型肝炎病毒的复制和细胞凋亡。

关键词：乙型病毒性肝炎泛素化泛素特异性蛋白酶7 凋亡去泛素化修饰

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泛素特异性蛋白酶15稳定着色性干皮病F蛋白并促进DNA链间交联损伤修复

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中国生物化学与分子生物学报 2019年第5期35卷 509-516页

作者：耿瑞赵美美王嘉东北京大学基础医学院放射医学教研室北京100191

着色性干皮病F蛋白(xeroderma pigmentosum group F,XPF)和切除修复交叉互补组1蛋白(excision repair cross complementing group 1,ERCC1)组成一种结构特异性的核酸内切酶(XPFERCC1)复合物,参与DNA链间交联(interstrand crosslink,ICL)损伤修复。其中,XPF蛋白的去泛素化修饰对DNA损伤修复的影响尚未见报道。本工作主要研究泛素特异性蛋白酶15 (ubiquitinspecific protease 15,USP15)对XPF的稳定性及ICL修复的影响。本研究通过蛋白质质谱和Western印迹法分析发现,XPF蛋白与USP15存在相互作用,进而使XPF蛋白去泛素化修饰;采用CRISPR-Cas9技术构建USP15基因敲除的He La细胞株(USP15 KO)并进行Western印迹分析,结果显示,敲除组XPF蛋白水平低于对照组(P去泛素化酶USP15是一种重要的DNA修复调节因子,该酶通过稳定XPF蛋白促进由XPF-ERCC1介导的ICL修复。本研究为改善ICL诱导剂类抗癌药物的耐药性提供了理论依据,并为肿瘤的治疗提供了潜在的新靶点。

关键词：泛素特异性蛋白酶USP15 核酸内切酶XPF-ERCC1 去泛素化修饰链间交联损伤

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泛素特异性蛋白酶7对HepG2.2.15细胞的炎症相关因子表达的影响

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中国临床药理学杂志 2021年第23期37卷 3279-3282页

作者：张咪马玉杨璐铭王林裴盛斐章广玲冯福民华北理工大学公共卫生学院河北唐山063200 华北理工大学临床医学院河北唐山063200 华北理工大学生命科学学院河北唐山063200

目的在预测miR-217对泛素特异性蛋白酶7(USP7)靶向作用的基础上探讨USP7在HepG2.2.15细胞中的促炎机制。方法将HepG2.2.15细胞分为对照组、转染组(siRNA-USP7)和阴性对照组(siRNA-NC)。检测细胞上清液中谷丙转氨酶(GPT)及谷草转氨酶(GOT... 详细信息

目的在预测miR-217对泛素特异性蛋白酶7(USP7)靶向作用的基础上探讨USP7在HepG2.2.15细胞中的促炎机制。方法将HepG2.2.15细胞分为对照组、转染组(siRNA-USP7)和阴性对照组(siRNA-NC)。检测细胞上清液中谷丙转氨酶(GPT)及谷草转氨酶(GOT)的含量;用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞上清液中乙型病毒性肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型病毒性肝炎e抗原(HBeAg)的含量;用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)测定USP7、核因子κB p65(NF-κB p65)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA含量;用蛋白质印迹(Western blot)法和ELISA法检测各指标蛋白含量;用免疫共沉淀法验证USP7与NF-κB p65的相互作用。结果对照组、转染组和阴性对照组的GPT含量分别为(13.45±0.07),(6.85±0.21)和(13.75±0.35)U·L^(-1);GOT含量分别为(15.10±0.57),(7.55±0.07)和(15.70±0.42)U·L^(-1);HBsAg含量分别为(3766.00±62.39),(2093.50±51.47)和(3727.00±55.73)pg·mL^(-1);HBeAg含量分别为(49.64±0.65),(27.49±0.60)和(49.59±1.13)pg·mL^(-1);USP7蛋白表达量分别为0.97±0.03,0.49±0.01和0.96±0.04;NF-κB p65蛋白表达量分别为0.73±0.03,0.46±0.02和0.76±0.01;IL-6蛋白表达量分别为(83.00±4.24),(43.00±4.24)和(82.50±3.54)pg·mL^(-1);TNF-α蛋白表达量分别为(95.00±2.83),(57.00±1.41)和(92.50±4.95)pg·mL^(-1),转染组与对照组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。免疫共沉淀显示USP7与NF-κB p65能够有效形成复合物。结论在乙型病毒性肝炎中,USP7呈现高表达,抑制USP7可减轻乙型病毒性肝炎细胞中NF-κB p65、IL-6以及TNF-α的表达,缓解肝细胞炎性损伤。

关键词：乙型病毒性肝炎泛素特异性蛋白酶7 核因子-κB p65 去泛素化修饰

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