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恒河猴粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因合成、原核表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2012年第3期25卷 309-313页

作者：刘娟陈丹李璐刘新颖王冉史洪娜王维龙沈林刘勇李鼎锋北京安百胜生物科技有限公司北京100176

目的人工合成恒河猴粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Macaca mulatta granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor,mGM-CSF)基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化。方法根据大肠杆菌遗传密码子偏爱性优化设计并合成mGM-CSF基因,克隆至原... 详细信息

目的人工合成恒河猴粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Macaca mulatta granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor,mGM-CSF)基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化。方法根据大肠杆菌遗传密码子偏爱性优化设计并合成mGM-CSF基因,克隆至原核表达载体pET-43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET-43.1a-mGM-CSF,转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL,IPTG诱导表达。表达的重组mGM-CSF蛋白经Sephacryl S-200分子筛层析纯化,复性后,Western blot检测其反应原性,MTT法检测其生物学活性。结果重组表达质粒pET-43.1a-mGM-CSF经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为15 000,表达量约占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度可达95%以上,并可与大鼠抗人GM-CSF单克隆抗体特异性结合,比活性为1.2×107IU/mg。结论在大肠杆菌中高效表达了重组mGM-CSF蛋白,纯化复性后的蛋白具有良好的生物学活性。

关键词：恒河猴粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,重组原核细胞基因表达纯化生物学活性

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A组人轮状病毒VP3基因的原核表达及鉴定

中国生物制品学杂志 2012年第2期25卷 152-156页

作者：张顺潘小霞袁静文喻玲陈元鼎中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的克隆并原核表达A组人轮状病毒(Rotavirus,RV)TB-Chen株结构蛋白VP3基因,并进行分子系统进化和基因分型。方法采用PCR法扩增A组人轮状病毒TB-Chen株VP3编码基因,克隆至pETL载体上,构建重组原核表达质粒pET-VP3,转化大肠杆菌BL21(DE3)... 详细信息

目的克隆并原核表达A组人轮状病毒(Rotavirus,RV)TB-Chen株结构蛋白VP3基因,并进行分子系统进化和基因分型。方法采用PCR法扩增A组人轮状病毒TB-Chen株VP3编码基因,克隆至pETL载体上,构建重组原核表达质粒pET-VP3,转化大肠杆菌BL21(DE3),并进行表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,对VP3基因进行分子系统进化及基因型分析。结果重组表达质粒pET-VP3经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为98 000,以包涵体形式存在;重组VP3蛋白可被抗SA11株全病毒豚鼠免疫血清识别;迄今发现的A组RV VP3可分为7个基因型,TB-Chen株和SA11株VP3基因分别属于M2型和M5型。结论成功原核表达了A组人RV TB-Chen株VP3蛋白,为进一步研究VP3的结构功能及开发新型RV疫苗、诊断试剂和治疗药物奠定了基础。

关键词：轮状病毒属 VP3基因原核细胞基因表达基因分型

新德里金属-β-内酰胺酶的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2012年第12期25卷 1663-1666,1670页

作者：赵祖国喻云梅刘炜许壁榆张腊喜刘仿杨银梅王凯周小棉徐军发丁元林广东医学院广东省医学分子诊断重点实验室广东东莞524808 解放军第422医院检验科广东湛江524005 广州医学院附属广州市第一人民医院检验科广州510180

目的原核表达新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1),并制备其多克隆抗体。方法以临床分离的产NDM-1的臭鼻克雷伯杆菌为模板,PCR扩增NDM-1基因,克隆入pET-28a载体,构建重组原核表达质粒pET-28a-NDM-1,转化E.c... 详细信息

目的原核表达新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1),并制备其多克隆抗体。方法以临床分离的产NDM-1的臭鼻克雷伯杆菌为模板,PCR扩增NDM-1基因,克隆入pET-28a载体,构建重组原核表达质粒pET-28a-NDM-1,转化E.coli BL21(DE3)pLyss,IPTG诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白经硫酸铵沉淀、离子交换层析、Ni亲和层析及分子筛层析纯化后,免疫日本大耳白兔,制备NDM-1多克隆抗体。抗体经硫酸铵沉淀和SPA-Sepharose亲和层析纯化后,Western blot鉴定其特异性。结果重组表达质粒pET-28a-NDM-1经PCR及测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为28 000,诱导表达的重组菌破菌上清存在较强的β-内酰胺酶活性,表明NDM-1蛋白为可溶性形式表达;最终纯化获得的NDM-1蛋白纯度高于95%;制备的NDM-1多克隆抗体能与诱导表达的重组菌胞外蛋白特异性结合。结论成功原核表达了NDM-1,并制备了其多克隆抗体,为NDM-1的快速检测提供了新的思路。

关键词：新德里金属-β-内酰胺酶原核细胞基因表达多克隆抗体

58型人乳头瘤病毒L2蛋白的原核表达、纯化及单克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2011年第4期24卷 398-403页

作者：林洁吕琦童亮刘芳马岚清华大学深圳研究生院生命学部广东深圳518055 云南大学生命科学学院单克隆抗体工程技术中心昆明650091

目的原核表达并纯化我国高发的致宫颈癌58型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)次要衣壳蛋白L2,并制备其单克隆抗体。方法从含有HPV-58基因组的质粒pHPV58中扩增L2基因,插入改构的原核表达载体pGEX-KGV中,转化大肠杆菌BL21(DE3),... 详细信息

目的原核表达并纯化我国高发的致宫颈癌58型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)次要衣壳蛋白L2,并制备其单克隆抗体。方法从含有HPV-58基因组的质粒pHPV58中扩增L2基因,插入改构的原核表达载体pGEX-KGV中,转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导表达,透析复性并亲和层析纯化重组蛋白,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并对其进行鉴定。结果重组表达质粒pGEX-KGV-HPV58 L2经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量可占菌体总蛋白的15.5%;纯化的重组蛋白纯度可达95%;共获得10株抗HPV-58 L2的高效价单克隆抗体。结论已成功原核表达、纯化了HPV-58 L2重组蛋白,并制备了单克隆抗体,为下一步HPV-58 L2蛋白抗原表位的研究以及相关预防性抗体药物和广谱重组疫苗的开发奠定了基础。

关键词： 58型人乳头瘤病毒 L2蛋白原核细胞基因表达蛋白质复性抗体,单克隆

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霍乱毒素A亚单位基因的原核表达及单克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2014年第6期27卷 780-783,788页

作者：陈健韦雨杏解晓燕朱召芹万延民徐建青温州医科大学浙江温州325035 上海市公共卫生临床中心上海201508 复旦大学生物医学研究院上海200032

目的原核表达并纯化霍乱毒素A亚单位（cholera toxin subunitA,CTA）基因,建立分泌CTA单克隆抗体的杂交瘤细胞系,并制备单克隆抗体。方法构建原核表达质粒pET30a-CTA,转化大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3）,IPTG诱导表达6 h,表达产物经... 详细信息

目的原核表达并纯化霍乱毒素A亚单位（cholera toxin subunitA,CTA）基因,建立分泌CTA单克隆抗体的杂交瘤细胞系,并制备单克隆抗体。方法构建原核表达质粒pET30a-CTA,转化大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3）,IPTG诱导表达6 h,表达产物经12%SDS-PAGE分析后,用Ni2＋亲和层析柱纯化;将纯化的重组CTA蛋白免疫C57BL/6小鼠,运用杂交瘤细胞技术制备抗CTA的单抗,采用Western blot法及体外阻断实验检测抗CTA单抗的特异性及对CT毒性作用的体外阻断。结果原核表达质粒pET30a-CTA经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确;表达的重组CTA蛋白在相对分子质量25 000～35 000之间可见明显的目的蛋白条带,纯化后的重组CTA蛋白纯度达90%以上;获得1株可分泌抗CTA单抗的杂交瘤细胞株G6C3-D10,可与CTA蛋白特异性结合,在相对分子质量25 000～35 000之间可见明显的特异条带;杂交瘤培养上清中CTA特异性抗体滴度为54,与CT混合后,可明显抑制CT所诱导的细胞内环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）水平的升高（P〉0.01）。结论原核表达并纯化了CTA基因,获得了能够分泌具有阻断CT毒性作用的单抗的细胞株,为CTA毒性作用和佐剂机制的进一步研究提供了参考。

关键词：霍乱毒素原核细胞基因表达杂交瘤细胞单克隆抗体

铜绿假单胞菌外毒素A基因突变体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

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中国生物制品学杂志 2014年第1期27卷 23-27页

作者：姚立红徐一陈爱珺郭建强薄洪尉玉杰张智清中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所卫生部医学病毒和病毒病重点实验室北京102206 中国动物疫病预防控制中心北京100125 莱阳市畜牧兽医局山东莱阳265200

目的将铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)基因突变为无毒性的ntPE基因,并在大肠埃希菌中进行表达。方法利用Primer Premier 5.0软件设计PEA基因引物及PEA基因第553位氨基酸缺失的突变引物,以铜绿假单胞菌(Pse... 详细信息

目的将铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)基因突变为无毒性的ntPE基因,并在大肠埃希菌中进行表达。方法利用Primer Premier 5.0软件设计PEA基因引物及PEA基因第553位氨基酸缺失的突变引物,以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)基因组DNA为模板,PCR扩增PEA基因,插入pGEM-T载体中,构建重组克隆质粒pGEM-PEA,以其为模板,利用突变引物,扩增ntPE基因(无毒性PEA),插入pET-30a载体中,构建原核表达质粒pET-ntPE,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析。结果测序结果证明已成功获得突变基因;原核表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约69 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%,可被小鼠抗PEA单克隆抗体特异性识别,具有较好的抗原性。结论已成功获得无毒性的PEA突变基因,为构建以PEA为蛋白佐剂的融合蛋白疫苗奠定了基础。

关键词：铜绿假单胞菌外毒素基因突变体原核细胞基因表达

登革病毒1型E蛋白第三结构域的原核表达及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2014年第12期27卷 1524-1528,1533页

作者：汪伟李竹石谭帅赵宇刘莉娜刘俐蔡峰曾献武杨会强成都生物制品研究所有限责任公司四川成都610023

目的在大肠埃希菌中表达登革病毒(Dengue virus,DENV)1型(DENV-1)E蛋白第三结构域(EⅢ),并分析重组蛋白的免疫原性。方法利用PCR技术从质粒p MD-D1pr M/E中扩增DENV-1的EⅢ序列,插入原核表达载体p ET-32a(+),构建重组表达质粒p ET-D1EⅢ... 详细信息

目的在大肠埃希菌中表达登革病毒(Dengue virus,DENV)1型(DENV-1)E蛋白第三结构域(EⅢ),并分析重组蛋白的免疫原性。方法利用PCR技术从质粒p MD-D1pr M/E中扩增DENV-1的EⅢ序列,插入原核表达载体p ET-32a(+),构建重组表达质粒p ET-D1EⅢ,转化至E.coli Rosetta2(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备多克隆抗体,采用Western blot法检测抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体滴度,蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)检测中和抗体效价。用纯化的重组蛋白免疫经腹部皮下多点注射BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后,用DENV-1(Hawaii株)经脑内攻击,分析重组蛋白对小鼠的免疫保护力。结果重组原核表达质粒p ET-D1EⅢ经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为33 000,主要以可溶性形式表达,占重组菌裂解上清蛋白量的52.37%;纯化的纯度可达90%以上,浓度达2 mg/ml;制备的多克隆抗体特异性强,效价高;重组蛋白能保护57.1%的小鼠免受致死剂量DENV的攻击。结论成功在E.coli Rossetta2(DE3)中高效表达了DENV-1 EⅢ蛋白,纯化的重组蛋白免疫家兔获得的多克隆抗体具有较强的特异性和较高的效价,且在小鼠免疫保护试验中显示出较好的保护力。本实验为进一步研究E蛋白的功能和登革新型疫苗的开发奠定了基础。

关键词：登革病毒 E蛋白第三结构域原核细胞基因表达免疫原性免疫保护力

HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2013年第9期26卷 1278-1284页

作者：张占东徐静李计来李树香周亚王欣怡刘敬张云涛北京生物制品研究所有限责任公司第三研究室北京100024

目的原核表达、纯化HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白,并分析其免疫原性。方法生物信息学方法预测鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的B细胞抗原表位,采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SO... 详细信息

目的原核表达、纯化HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白,并分析其免疫原性。方法生物信息学方法预测鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的B细胞抗原表位,采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法将VEGF抗原表位基因插入到HBcAg基因的免疫优势区内,合成HBcAg-VEGF基因序列,克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-HBcAg-VEGF,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经羟基磷灰石CHT层析、Sephacryl S-400HR凝胶过滤层析纯化后,与Al（OH）3佐剂混合,分别于第0、7、14、21天经肌肉免疫BALB/c小鼠1次,第28天采血,ELISA法检测血清中抗VEGF抗原表位抗体,VEGF受体结合抑制试验筛选具有良好免疫原性的VEGF优势抗原表位。对筛选出的优势抗原表位融合蛋白进行表达及纯化条件的优化。结果生物信息学软件预测了6个VEGF的B细胞抗原表位;6个重组表达质粒经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白相对分子质量为14400～20100,纯度均在85%以上,除HBcAg-VEGF3以单体形式存在、不形成颗粒外,其他融合蛋白均能形成VLP;各组HBcAg-VEGF融合蛋白免疫小鼠后,均刺激机体产生了针对VEGF抗原表位肽的特异性抗体,其中HBcAg-VEGF1组抗体水平最高,且抑制VEGF与VEGFR结合的能力最强;采用优化的条件表达、纯化的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白纯度达95%以上。结论筛选得到的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白显示出较好的免疫原性,为进一步研究其抗肿瘤效应奠定了基础。

关键词：血管内皮生长因子乙型肝炎核心抗原抗原表位融合蛋白原核细胞基因表达免疫原性

肺炎链球菌DnaJ蛋白的原核表达及其免疫保护效果

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中国生物制品学杂志 2013年第6期26卷 754-759页

作者：游文献曹炬重庆医科大学附属第一医院消化内科重庆400016

目的原核表达肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)热休克蛋白40(heat shock protein 40,HSP40,DnaJ),并探讨其免疫保护效果。方法从2、3、6B、14、19F、R6型肺炎链球菌基因组DNA中扩增DnaJ基因,插入原核表达载体pET-32a中,构建重组表... 详细信息

目的原核表达肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)热休克蛋白40(heat shock protein 40,HSP40,DnaJ),并探讨其免疫保护效果。方法从2、3、6B、14、19F、R6型肺炎链球菌基因组DNA中扩增DnaJ基因,插入原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-DnaJ,转化大肠埃西菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组DnaJ蛋白经Ni-NTA树脂纯化后,分别经腹腔和鼻黏膜免疫小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清和唾液中特异性IgG和IgA抗体滴度;用重组蛋白刺激小鼠脾细胞,ELISA法检测细胞因子水平的变化;流式细胞术检测特异性抗DnaJ血清结合到肺炎链球菌表面的能力;检测抗DnaJ血清抑制R6型肺炎链球菌黏附A549细胞的能力。结果 6株肺炎链球菌的PCR扩增产物均可见1 119 bp的DnaJ基因片段,测序结果与GenBank中登录的序列一致;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;纯化的重组DnaJ蛋白相对分子质量约为38 000,纯度达90%以上,可与DnaJ小鼠免疫血清发生特异性反应。腹腔免疫DnaJ可使小鼠血清产生高滴度的特异性抗DnaJ抗体,鼻黏膜免疫DnaJ可增加小鼠血清和黏膜中抗DnaJ IgG和IgA抗体水平(P细胞释放高水平的细胞因子IL-10、IFNγ和IL-17A;抗DnaJ血清对肺炎链球菌具有更强的结合能力,且可抑制肺炎链球菌黏附肺癌上皮细胞A549。结论 DnaJ可诱导小鼠产生保护性免疫应答,提示其具有作为肺炎链球菌蛋白疫苗抗原的潜力。

关键词：肺炎链球菌 DnaJ蛋白原核细胞基因表达免疫保护