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卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD全长cDNA序列的克隆与表达分析

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生物技术通报 2015年第7期31卷 115-123页

作者：韩洪波王忠良陈刚汤保贵张健东黄建盛周晖施纲潘传豪广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省普通高校南海水产经济动物增养殖重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088

采用c DNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的c DNA全长序列,并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析... 详细信息

采用c DNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的c DNA全长序列,并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了该基因在不同温度条件下的表达差异及低温下的时序表达模式。结果显示,卵形鲳鲹△6FAD基因c DNA序列全长1 908 bp,其中开放阅读框为1 329 bp,3'非编码区431 bp,5'非编码区135 bp,共编码442个氨基酸;其编码蛋白属于疏水性蛋白,无信号肽特征,含有大量蛋白质二级结构和该家族典型的组氨酸富集区及细胞色素b5结构域。系统进化分析表明,卵形鲳鲹△6FAD基因与尖吻鲈、军曹鱼的△6FAD基因在进化关系上最为接近,其次是大菱鲆、蓝鳍金枪鱼和点带石斑鱼,但与斑马鱼、小鼠和人△6FAD基因进化关系较远。实时荧光定量PCR结果表明,该基因的表达与环境温度和胁迫时间存在明显相关性,其表达水平在降温过程中随温度降低而先缓慢下降后又迅速升高,在不同的低温环境下表现出不同的时序表达模式:13℃时,随时间延长该基因的表达量呈现先降低后又升高至原来水平的变化趋势,16℃和19℃时则表现出一种随时间延长逐渐降低的反馈式调节方式。

关键词：卵形鲳鲹 △6脂肪酸去饱和酶 cDNA克隆低温胁迫

卵形鲳鲹趋化因子CCL4（TroCCL4）参与机体抗菌免疫反应

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卵形鲳鲹趋化因子CCL4（TroCCL4）参与机体抗菌免疫反应

作者：孙佰鸣海南大学

学位级别：硕士

CC类趋化因子作为趋化因子的亚族,在先天免疫系统中起重要作用。迄今为止,CC趋化因子已经在多种鱼类中被研究并证实具有先天免疫作用。然而,在其它鱼类中CC趋化因子的研究仍显不足,本研究中,我们以卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)为研究对... 详细信息

CC类趋化因子作为趋化因子的亚族,在先天免疫系统中起重要作用。迄今为止,CC趋化因子已经在多种鱼类中被研究并证实具有先天免疫作用。然而,在其它鱼类中CC趋化因子的研究仍显不足,本研究中,我们以卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)为研究对象,对其趋化因子CCL4(TroCCL4)的序列特征、表达调控规律及功能进行分析。结果显示,TroCCL4含有294 bp的开放阅读框,编码98个氨基酸。TroCCL4与人和其它硬骨鱼的CCL4所编码的氨基酸序列具有31.11%-78.35%的相似性,并且具有四个保守的半胱氨酸残基。系统进化分析结果显示,TroCCL4属于CC趋化因子的MIP亚组。在健康的卵形鲳鲹中,TroCCL4的表达量在免疫器官中最丰富,经Edwardsiella tarda感染后,TroCCL4的表达量在48 h内随感染时间的增加而显著上调。然后,我们构建了原核重组表达质粒并表达了原核重组的TroCCL4蛋白(rTroCCL4),进而对rTroCCL4的功能进行研究,结果表明该蛋白能诱导外周血白细胞(PBL)的迁移和头肾淋巴细胞(HKL)的细胞增殖;此外,rTroCCL4能显著抑制迟缓爱德华氏菌和大肠杆菌的生长,表明其具有一定的抗菌功能。体内实验的结果表明,在卵形鲳鲹中,当TroCCL4过表达时,能显著提高巨噬细胞的活性;同时能显著上调免疫相关基因白细胞介素1-β(IL-1β),白细胞介素15(IL15),干扰素诱导的Mx蛋白(Mx),肿瘤坏死因子α(TNFα),补体C3和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰα和Ⅱα的表达水平,并显著减少感染卵形鲳鲹的细菌数量;当干扰TroCCL4的表达时,会显著增加感染卵形鲳鲹的细菌数量。终上所述,本研究表明了 TroCCL4具有趋化外周血白细胞、增殖淋巴细胞、提高巨噬细胞活性的功能,并能通过提高宿主免疫力来增强卵形鲳鲹抵御细菌感染的能力。

关键词：卵形鲳鲹 CC型趋化因子迁移增殖抑菌能力

卵形鲳鲹IGFBP3（TroIGFBP3）参与机体抗菌免疫应答研究

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卵形鲳鲹IGFBP3（TroIGFBP3）参与机体抗菌免疫应答研究

作者：陈阳海南大学

学位级别：硕士

胰岛素样生长因子结合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein 3,IGFBP3)是IGFBP家族的重要成员之一。目前,在哺乳动物中有关IGFBP3的研究主要集中在调节细胞增殖、分化、生长、凋亡和先天免疫等方面,但在硬骨鱼类中有关IGF... 详细信息

胰岛素样生长因子结合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein 3,IGFBP3)是IGFBP家族的重要成员之一。目前,在哺乳动物中有关IGFBP3的研究主要集中在调节细胞增殖、分化、生长、凋亡和先天免疫等方面,但在硬骨鱼类中有关IGFBP3的研究相对匮乏。为此,本文以卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)为研究对象,克隆并鉴定了卵形鲳鲹IGFBP3(Tro IGFBP3)基因,分析了其序列结构特征,并且对其在体内外的功能进行了初步研究。主要内容及结果如下:1.本研究从卵形鲳鲹肝脏中克隆得到了Tro IGFBP3,序列编码区长861 bp,共编码286个氨基酸,其中包含21个氨基酸的信号肽,其相对分子质量29 k Da,理论等电点为8.802。序列同源性分析表明,Tro IGFBP3与其他硬骨鱼IGFBP3有很高的同源性(58.1%～93.71%)。其中,与眼斑双锯鱼(Amphiprion ocellaris)同源性最高,达93.71%。系统进化树结果显示,Tro IGFBP3与同为鲈形目的眼斑双锯鱼聚为一个分支,亲缘关系最近。2.组织特异性分析的结果显示,Tro IGFBP3在健康卵形鲳鲹各组织中均有表达,而在肝脏、脾脏和头肾等免疫器官中表达量较高,其中在肝脏的表达量最高,在皮肤中最低。在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染24 h后,Tro IGFBP3在肝脏、脾脏和头肾中的表达量均显著上调,其中在肝脏中的表达量显著上调20.21倍、脾脏显著上调13.87倍、头肾显著上调13.91倍。3.本研究成功构建并诱导表达了Tro IGFBP3的融合蛋白r Tro IGFBP3。体外实验证明,r Tro IGFBP3与头肾巨噬细胞、外周血白细胞孵育后,可显著提高巨噬细胞的吞噬活性,并且促进外周血白细胞的增殖。此外,我们还发现,r Tro IGFBP3可以显著抑制小鼠肝癌细胞的增殖,并且促进小鼠肝癌细胞的凋亡。4.亚细胞定位的结果显示IGFBP3在卵形鲳鲹吻细胞的细胞核和细胞质中均有表达;体内实验的结果表明,在鱼体中过量表达IGFBP3后,可显著提高机体抗菌能力,肝脏、脾脏、头肾在V.harveyi侵染后,细菌数量相比对照组显著降低。与此一致的是,当干扰鱼体内Tro IGFBP3的表达后,机体的抗菌能力显著降低,V.harveyi侵染后,各组织中的细菌数量显著增多。综上所述,我们的实验结果表明卵形鲳鲹Tro IGFBP3能提高机体的抗菌免疫应答,并且能够促进小鼠肝癌细胞的凋亡。该研究将丰富我们对卵形鲳鲹抗细菌免疫机制的认知,为卵形鲳鲹人工养殖的健康持续发展提供新的研究思路。此外其抗肿瘤作用也将会给生物学、医学等领域提供新的研究视角。

关键词：胰岛素样生长因子结合蛋白3 卵形鲳鲹抗细菌免疫肝癌细胞

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卵形鲳鲹NF-κB家族基因克隆与表达分析

卵形鲳鲹NF-κB家族基因克隆与表达分析

作者：段家文广西大学

学位级别：硕士

核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）蛋白包括NF-κB1、NF-κB2、Rel A、Rel B和c-Rel,以二聚体的形式构成转录调控因子,能够结合靶基因的NF-κB结合位点,调控靶基因的表达,参与机体的免疫应答、细胞凋亡、癌症等多种生物学过... 详细信息

核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）蛋白包括NF-κB1、NF-κB2、Rel A、Rel B和c-Rel,以二聚体的形式构成转录调控因子,能够结合靶基因的NF-κB结合位点,调控靶基因的表达,参与机体的免疫应答、细胞凋亡、癌症等多种生物学过程。卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）已成为我国南方重要的经济养殖鱼类,每年由于病害给卵形鲳鲹养殖业造成巨大经济损失。鉴定卵形鲳鲹免疫相关分子,解析其结构与免疫反应规律,将为制定新的免疫和病害防控策略提供科学参考。鉴于NF-κB信号通路在机体中的重要作用,本研究克隆鉴定了卵形鲳鲹NF-κB（Tro NF-κB）家族基因;分析其在正常组织中的表达分布以及在刺激后的表达变化规律;最后完成TroRelB重组蛋白的表达纯化与其多克隆抗的制备。现将主要研究结果归纳如下:1、采用RT-PCR和RACE等分子生物学技术,获得Tro NF-κB家族基因（Tro NF-κB1、Tro NF-κB2、Tro Rel A、TroRelB和Troc-Rel）的全长c DNA分别为4215 bp、3836 bp、3167 bp、2781 bp和3501 bp;ORF长度分别为2826 bp、2715 bp、1866 bp、1728 bp和1947 bp;分别编码941、904、621、575和648个氨基酸。Tro NF-κB家族5个蛋白均含有1个RHD结构域和1个IPT结构域,而Tro NF-κB1和Tro NF-κB2均存在DD结构域和ANK结构域。同源性分析结果显示,Tro NF-κB1、Tro NF-κB2、Tro Rel A、TroRelB和Troc-Rel蛋白与鱼类的同源性较高,分别为81.2-88.4%、83.8-95.1%、86.0-93.5%、62.3-87.3%和83.5-91.2%。进化树分析结果表明,上述5个蛋白分别与其他鱼类聚为一支,表明其亲缘关系较近。综上所述,Tro NF-κB家族基因在进化过程中相对保守,并推断其对应的功能也相对保守。2、应用qPCR检测NF-κB家族基因在健康卵形鲳鲹心脏、肝脏、脾脏、头肾、皮肤、脑、鳃、胃、肠和肌肉等组织的表达分布,结果表明,Tro NF-κB家族基因在所检组织中均有表达,呈组成型分布,表明其参与基础的生命活动。这些基因在不同组织中的表达丰度并不相同,其中,Tro NF-κB1、TroRelB和Troc-Rel均在脾脏组织中表达最高;Tro NF-κB2和Tro Rel A在肝脏中表达最高;它们均在皮肤组织中表达最低。上述5个基因在免疫相关组织中的表达较高,暗示Tro NF-κB家族基因参与先天免疫反应的调控。3、LPS、poly I:C和溶藻弧菌刺激后,Tro NF-κB家族5个基因在肌肉组织中的表达变化不显著,在肝脏、脾脏和头肾中表达均显著上调（P＜0.05）,具体表达变化如下:（1）LPS刺激后,肝脏中Tro NF-κB1的表达水平在12 h和24 h显著上调,脾脏和头肾中的表达量在刺激6 h和12 h显著上调;所检组织中Tro Rel A的表达上调显著的时间点与Tro NF-κB1类似,不同的是头肾中Tro Rel A的表达量在刺激后12 h不显著上调;肝脏、脾脏和头肾中Tro NF-κB2、TroRelB和Troc-Rel的表达在刺激后12 h均显著上调,头肾和肝脏中Tro NF-κB2的表达分别在6 h和24 h显著上调至峰值;头肾和脾脏中Troc-Rel的表达量分别在刺激后6 h和24 h达到峰值;TroRelB的表达情况与Troc-Rel类似,不同点是头肾中的表达量在刺激24 h显著上调。（2）poly I:C刺激后,脾脏和肝脏中Tro NF-κB1的表达量分别在刺激后6 h和12 h达到峰值,头肾中的表达在6 h逐渐上调至24 h达到最高水平;肝脏和脾脏中Tro NF-κB2的表达量在刺激后6 h显著上调至12 h到达最大值,头肾中的表达量在12 h达到峰值;Tro Rel A的表达模式与Tro NF-κB2类似,不同点是头肾中其表达在刺激6 h和24 h显著上调;肝脏和头肾中TroRelB的表达水平在刺激12 h达到峰值,而脾脏的表达量在6 h快速升至峰值,随后在12 h下降又在24 h显著上升;Troc-Rel在肝脏、脾脏和头肾中的表达均在刺激后24 h显著上调,肝脏中的表达量在48 h时达到峰值。（3）感染溶藻弧菌后,肝脏中Tro NF-κB1的表达水平在刺激后6 h到达峰值,肝脏、脾脏和头肾组织中的表达在刺激后12 h和24 h均显著上调;头肾、肝脏和脾脏中Tro NF-κB2的表达分别在刺激后6 h、24 h和24 h达到最高水平,肝脏和头肾中其表达在12 h显著上调;肝脏、脾脏和头肾中Tro Rel A的表达量分别在刺激后24 h、12 h和48 h显著上调至峰值

关键词：卵形鲳鲹 NF-κB 表达分析蛋白表达与纯化多克隆抗体

卵形鲳鲹脂肪酸延长酶和去饱和酶基因的功能鉴定及转录调控研究

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卵形鲳鲹脂肪酸延长酶和去饱和酶基因的功能鉴定及转录调控研究

作者：宋岭上海海洋大学

学位级别：硕士

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFA)是鱼类仔、稚鱼生长发育所必需的。目前,无脊椎动物和淡水鱼被证实是具有从头合成PUFA的能力,而海水鱼合成PUFA的能力缺乏或很弱。近年来研究发现,黄斑蓝子鱼(Siganus canaliculatus)... 详细信息

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFA)是鱼类仔、稚鱼生长发育所必需的。目前,无脊椎动物和淡水鱼被证实是具有从头合成PUFA的能力,而海水鱼合成PUFA的能力缺乏或很弱。近年来研究发现,黄斑蓝子鱼(Siganus canaliculatus)、塞内加尔鳎(Solea senegalensis)等海水鱼可以将亚油酸和亚麻酸合成LC-PUFA(long-chain polyunsaturated fatty acid)。目前对于华南地区重要的海水养殖鱼类的卵形鲳鲹是否具有将亚油酸和亚麻酸转化成LC-PUFA的能力,还不清楚,且LC-PUFA合成通路上的关键酶,脂肪酸延长酶(Elongases of very long chain fatty acids,Elovls)和脂肪酸去饱和酶(Fatty acid desaturases,Fads)的功能研究也鲜有报道,因此阐明Elovls和Fads在PUFA合成途径中功能及转录调控机制,对于明晰PUFA合成途径中的网络调控通路具有重要意义,同时将有助于探明海水鱼类PUFA合成能力普遍低下的原因。为了研究卵形鲳鲹LC-PUFA合成的调控机制,本研究克隆了卵形鲳鲹LC-PUFA合成通路上的关键酶Elovl4a、Elovl4b、Elovl4-like和Fads2a、Fads6基因的c DNA,运用q PCR技术分析了其组织表达谱,利用酵母异源表达研究了其功能特征,采用启动子活性分析和点突变技术初步解析了Elovl4a和Fads6的转录调控机制。取得的主要结果如下:1.Elovls和Fads生物信息学和组织表达分析。Elovl4a、Elovl4b、Elovl4-like c DNA全长分别1606 bp、2430 bp、2180 bp,开放阅读框(ORF)分别编码320、305、263个氨基酸,其编码区氨基酸序列均含Elovl4家族的显著结构特征;多重序列比对显示,均与其他硬骨鱼类的同源蛋白具有较高的相似性;系统发育分析显示,Elovl4a、Elovl4b、Elovl4-like与其他物种的Elovl4类似蛋白聚为一大支。Fads2a和Fads6 c DNA全长分别为2041 bp、1594 bp,ORF分别编码442和380个氨基酸;多重序列比对显示,均与其他硬骨鱼的同源蛋白相似性较高,且具有Fads家族的显著结构特征。系统进化分析表明,Fads2a和Fads6分别与其他物种的同源蛋白聚为一支。组织表达谱分析显示,Elovl4a m RNA在脑组织中表达量最高;Elovl4b m RNA在雄性性腺、雌性性腺和脑组织中表达量最高;Elovl4-like m RNA在雄性性腺、脾、雌性性腺组织中表达量最高;Fads2a和Fads6 m RNA都在脑组织中表达量最高。2.Elovls和Fads基因的功能研究。利用酵母异源表达检测卵形鲳鲹Elovls和Fads基因功能。酵母异源表达分析表明,Elovl4a能将C18:3n-6延长为C20:3n-6,转化率为1.05%;Elovl4b能将C18:2n-6、C18:3n-6和C20:5n-3分别延长为C20:2n-6、C20:3n-6和C22:5n-3,转化率分别为5.16%、5.42%、9.35%;Elovl4-like能将C18:2n-6和C20:5n-3分别延长为C20:2n-6和C22:5n-3,转化率分别为0.83%和0.82%;Fads2a和Fads6都具有Δ4/Δ5/Δ8去饱和酶的功能。Fads2a和Fads6均能将C20:2n-6、C20:3n-6、C22:5n-3、C22:4n-6分别转化为C20:3n-6、C20:4n-6、C22:6n-3、C22:5n-6,Fads2a转化率分别为0.18%、0.56%、43.82%、1.24%,Fads6转化率分别为0.17%、0.54%、39.29%、1.04%。依据本实验室对卵形鲳鲹Elovls和Fads的功能研究结果来看,卵形鲳鲹是具有完整的不饱和脂肪酸合成通路的,其体内存在“延长酶-?8-?5”的合成通路。3.Elovl4a和Fads6的转录调控机制。通过构建一系列的缺失体及启动子活性分析,结果表明Elovl4a的核心启动子区域位于(-148 bp～+258 bp),且Elovl4a转录受转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARαb,Peroxisome proliferator-activated receptors)的正调控。点突变分析表明靶向突变PPARαb的M2结合位点(+209 bp～+223 bp)后,Elovl4a启动子的转录活性显著降低。此外,Fads6的核心启动子区域位于(-448 bp～+1 bp),其转录同样受PPARαb的正调控。点突变分析表明靶向突变PPARαb的M2结合位点(-113 bp～-87 bp)后,Fa

关键词：卵形鲳鲹脂肪酸延长酶脂肪酸去饱和酶异源表达转录调控

卵形鲳鲹Toll样受体家族部分基因的特征与功能研究

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卵形鲳鲹Toll样受体家族部分基因的特征与功能研究

作者：吴梦上海海洋大学

学位级别：硕士

卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）是一种优质的海水食用鱼,因其生长速度快,容易养殖,味道鲜美,营养价值高,成为我国南方目前重要的海水养殖品种之一。然而随着养殖方式的进步和养殖密度的增加,因病原微生物感染而引发的问题频繁发生,严... 详细信息

卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）是一种优质的海水食用鱼,因其生长速度快,容易养殖,味道鲜美,营养价值高,成为我国南方目前重要的海水养殖品种之一。然而随着养殖方式的进步和养殖密度的增加,因病原微生物感染而引发的问题频繁发生,严重影响了卵形鲳鲹养殖业的发展。卵形鲳鲹免疫机制的研究可以为如何提升卵形鲳鲹抗病免疫力提供一定的基础。其中Toll样受体作为一类重要的模式识别受体,是鱼类免疫中重要组成部分,在抵御病原微生物的入侵中有着重要的作用。本研究从卵形鲳鲹基因组和转录组数据中筛选得到了Toll样受体家族部分基因c DNA片段和基因片段。利用RACE技术克隆了卵形鲳鲹Toll样受体家族部分基因c DNA序列,并分析了其序列特征,利用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）技术分析其在卵形鲳鲹不同组织及聚胞肌苷酸（Poly I:C）、鞭毛蛋白（Flagellin）和脂多糖（LPS）刺激后的表达模式。通过构建卵形鲳鲹To TLR3、To TLR5M和To TLR5S基因胞外重组质粒,成功表达出胞外蛋白,并对重组蛋白结合活性进行分析。克隆了卵形鲳鲹TLR3、TLR5M和TLR5S的启动子序列并分析其结构特点,通过构建启动子缺失体,利用双荧光素报告检测基因启动子活性。通过构建卵形鲳鲹To TLR3、To TLR5M和To TLR5S真核重组表达质粒,利用石斑鱼脾脏细胞检测基因过表达对NF-κB激活程度,对基因功能进行了初步的探究。主要结果如下:（1）本研究克隆获得了卵形鲳鲹4种Toll样受体基因的c DNA序列及基因序列。To TLR3基因c DNA序列全长3710 bp,包括558 bp的5’非编码区、2760 bp的开放阅读框和392 bp的3’非编码区,编码919个氨基酸;基因序列包含5个外显子和4个内含子。To TLR5M基因c DNA序列3644 bp,包含612 bp的5’非编码区、2673 bp的开放阅读框和359 bp的3’非编码区,编码890个氨基酸;基因序列包含4个外显子和3个内含子。To TLR5S基因全长2329 bp,包含156 bp的5’非编码区、1935 bp的开放阅读框和238 bp的3’非编码区,编码644个氨基酸;基因序列仅含一个内含子。To TLR14基因c DNA序列全长3191 bp,包含130 bp的5’非编码区、2631 bp的开放阅读框和430 bp的3’非编码区,编码876个氨基酸;基因序列包含4个内含子和5个外显子。四种基因均含有TLR蛋白的典型结构域,除To TLR5S外其余3种TLR蛋白均有TIR区域,其TIR结构域包含3个保守的功能区域。系统进化树显示,TLR基因在不同鱼类中进化关系较为稳定,而与哺乳动物和鸟类有一定的距离。（2）卵形鲳鲹TLR3、TLR5M、TLR5S和TLR14在各组织中均有表达,但其表达水平具有组织差异性。To TLR3在卵形鲳鲹的血液和肝脏中表达量较高,皮肤、肾脏和肠中表达量次之,鳃中表达水平最低。To TLR5M在卵形鲳鲹的肠、肾脏和肝脏中表达量较高,血液、皮肤和鳃中表达量次之,肌肉中表达量最低。To TLR5S在卵形鲳鲹的血液、肾脏和脾脏中表达量较高,皮肤、肠和肝脏中表达量次之,胃中表达量最低。To TLR14在卵形鲳鲹皮肤中的表达量最高,其次是肠和肾脏,胃组织中表达水平最低。（3）卵形鲳鲹在经Poly I:C、鞭毛蛋白和脂多糖刺激后TLR3、TLR5M、TLR5S和TLR14均表现出明显的表达响应,显示TLRs在卵形鲳鲹免疫应答反应中发挥重要作用。To TLR3在Poly I:C刺激后上调程度较为明显,说明卵形鲳鲹TLR3和哺乳动物一样,主要识别ds RNA。To TLR5M对3种刺激物均有表达量上调的现象,表明卵形鲳鲹TLR5M在抗细菌和抗病毒的免疫反应中发挥重要作用。在鞭毛蛋白刺激后大部分组织中To TLR5S上调程度较为明显,推测卵形鲳鲹TLR5S可能主要识别鞭毛蛋白,然而在肝脏中却是脂多糖刺激后To TLR5S上调程度最为显著,预示着卵形鲳鲹TLR5S可能在肝脏中起着重要作用。在Poly I:C和鞭毛蛋白刺激后To TLR14的表达量均在血液和肝脏中显著上调,而在脂多糖刺激后To TLR14肝脏中表达量上调最为显著,这表明卵形鲳鲹TLR14可能在血液和肝脏中对病毒和细菌刺激的免疫应答起着重要作用。（4）本研究构建了卵形鲳鲹TLR3、TLR5M和TLR5S基因胞外区片段的重组原核表达载体,成功得到了To TLR3、To TLR5M和To TLR5S胞外重组蛋白,而且3种重组蛋白均以包涵体的形式表达,对重组蛋白进行复性和纯化后得到目的蛋白。采用ELISA方法对重组蛋白进行功能研究,结果显示3种重组蛋白均对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有明显的结合活性。上述结果说明To TLR3、To TLR5M和To TLR5S可能识别并结合某些细菌的病

关键词：卵形鲳鲹 Toll样受体基因表达原核表达功能分析

卵形鲳鲹TAK1、TAB1和TAB2基因的克隆与表达分析

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卵形鲳鲹TAK1、TAB1和TAB2基因的克隆与表达分析

作者：雷坤广西大学

学位级别：硕士

卵形鲳鲹作为我国南方沿海地区一种重要的海水养殖鱼类,其面临养殖环境恶化和病害频发的挑战。鉴定和研究卵形鲳鲹免疫相关分子,将有助于制定病害防控新策略。TAK1是MAP3K家族中的重要成员;TAB1和TAB2是TAK1的结合蛋白。TAK1与TAB1结合... 详细信息

卵形鲳鲹作为我国南方沿海地区一种重要的海水养殖鱼类,其面临养殖环境恶化和病害频发的挑战。鉴定和研究卵形鲳鲹免疫相关分子,将有助于制定病害防控新策略。TAK1是MAP3K家族中的重要成员;TAB1和TAB2是TAK1的结合蛋白。TAK1与TAB1结合引起TAK1磷酸化,而与TAB2结合及泛素作用后导致TAK1泛素化。TAK1发生磷酸化和泛素化而具有激酶活性,可激活NF-κB和MAPKs信号通路,影响机体先天免疫、适应性免疫、细胞分化、组织修复和自身免疫性炎症等生命活动过程。本研究应用分子生物学技术和生物信息学的方法,获得了卵形鲳鲹TAK1（TroTAK1）、TroTAB1和TroTAB2基因的c DNA全长、解析基因结构与功能、探讨进化与同源关系;检测3个基因m RNA在健康卵形鲳鲹组织中的表达情况;分析LPS、poly I:C与溶藻弧菌刺激后3个基因m RNA在免疫相关组织中的应答规律;构建原核表达载体,进行重组蛋白的表达与纯化。所取得的主要研究成果如下:1、获得TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因的cDNA全长分别为2429bp、2067 bp和4229 bp,预测其开放阅读框分别为1728 bp、1521 bp和2280bp,分别推定编码575、506和759个氨基酸。蛋白结构预测发现TroTAK1蛋白氨基端具有一个S＿TKc结构域,羧基端存在一个CCR结构域;TroTAB1蛋白羧基端具有一个PP2C＿SIG结构域;TroTAB2蛋白具有三个结构域分别为CUE结构域、Zn F结构域和CCR结构域。同源性分析显示3个基因氨基酸序列与其他鱼类的同源性较高,分别为95.7-97.9%、92.1-96.4%和87.1-98.0%;进化树上的物种分为鱼类、爬行类、哺乳类和鸟类四枝,TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2蛋白都分别与鱼类聚为一枝。以上结果表明TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因为其他脊椎动物TAK1、TAB1和TAB2基因的同源物,并在鱼类中高度保守。2、实时荧光定量PCR检测发现TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因在健康卵形鲳鲹鳃、脑、心脏、头肾、肌肉、肝脏、脾脏和肠均有表达,但表达水平不同。其中,TroTAK1在肝脏中表达量最高,脑中表达量次之;TroTAB1在脾脏中表达量最高,心脏中表达量次之;TroTAB2在肠中的表达水平最高,肝脏中表达次之;3个基因均在肌肉中表达水平最低。这些结果说明TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2参与了卵形鲳鲹基本的生命活动。3、LPS、polyI:C和溶藻弧菌刺激后3个基因的免疫应答:（1）LPS刺激后,在头肾、脾脏、肝脏和鳃组织中,TroTAK1基因的表达量在刺激后6h时间点无显著升高,在12和24 h表达量则显著上调,随后降低,在48 h表达量虽上调,但差异不显著。在头肾和脾脏中,TroTAB1基因表达水平在刺激后12和24 h显著上升;在肝脏中,除12和24 h时间点显著上升外,在48 h也显著上升;而鳃中仅在12 h检测到表达水平的显著上调。在脾脏中,TroTAB2基因表达量于刺激后6、12和24 h时间点显著上调;而在鳃、肝脏和头肾中表达水平分别在6、12和24 h时间点到达最高值,随后逐渐降低。（2）poly I:C刺激后第6和12 h,头肾中TroTAK1表达量显著上调;TroTAK1在肝脏和鳃中表达模式相似,均在6 h上升,12 h达到峰值;脾脏中TroTAK1表达水平在6和24 h时间点显著上调。TroTAB1基因在头肾、肝脏和鳃中表达模式类似,均在24 h显著上升,在6、12和48 h时间点上升但差异不显著;而脾脏中的表达水平在12 h显著上升,在24 h达到最大值。在肝脏和脾脏中,TroTAB2基因表达量在刺激后12和24 h均显著上调;而在头肾和鳃中仅12 h时间点检测到表达水平的显著上升。（3）溶藻弧菌刺激后,肝脏中TroTAK1基因表达量在0 h后的各检测时间点显著上调;在脾脏和鳃中表达模式类似,表达量均在刺激后12 h达到峰值,随后下降,48 h时间点已无显著上调;而头肾中表达量在刺激后12和24 h显著上调。TroTAB1在肝脏、鳃和脾脏中6 h时间点表达量上升,12 h到达峰值,随后下降,48 h时间点已无显著上调;而头肾中仅在刺激后24 h检测到TroTAB1表达量的显著上调。TroTAB2基因在肝脏和鳃中表达量在刺激后12 h到达峰值;脾脏中TroTAB2基因表达量在刺激后6、12和24 h显著上调;而在头肾中仅在24 h检测到表达量显著上升。以上结果表明TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因参与了卵形鲳鲹抵御细菌和病毒感染的先天免疫过程。4、构建TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2基因原核表达载体,诱导表达了TroTAK1、TroTAB1和TroTAB2重组

关键词：卵形鲳鲹 TAK1 TAB1 TAB2 表达分析蛋白纯化

卵形鲳鲹TLR21、TLR22及相关基因的克隆与表达分析

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卵形鲳鲹TLR21、TLR22及相关基因的克隆与表达分析

作者：徐腾广西大学

学位级别：硕士

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)作为一类重要的模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs),主要负责识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),启动先天免疫系统抵御病原微生物的入侵。TLRs除了启动先天免疫外,还可调节适应性免疫,是连接先天免疫和适应性免疫的桥梁。TLR21和TLR22是TLRs家族的重要成员,主要存在于鸟类、两栖类或鱼类中;TRAF3和IRAK1是TLRs信号转导通路中的重要分子,在TLRs信号转导级联反应中具有重要作用。卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是我国南方重要的海水养殖经济鱼类,随着养殖规模的不断扩大,病害不时发生,给卵形鲳鲹养殖业带来巨大经济损失。鉴于TLR21、TLR22、TRAF3和IRAK1在免疫中具有重要功能,本研究采用RACE-PCR和RT-PCR技术克隆了卵形鲳鲹TLR21(TrTLR21)、TrTLR22、TrTRAF3和TrIRAK1基因;应用生物信息学分析上述基因的序列特征和蛋白结构;采用荧光定量PCR技术分析上述基因在健康卵形鲳鲹组织中的分布;检测溶藻弧菌、LPS或PolyI:C刺激后上述基因在鳃、脾脏、头肾和肝脏中的免疫应答规律。主要研究成果如下:1.TrTLR21、TrTLR22、TrTRAF3 和 TrIRAK1 基因 cDNA全长分别为3184bp、3454bp、2818bp和2564bp。其中,TrTLR21和TrTLR22开放阅读框分别为2931 bp和2880 bp,推定编码976和959个氨基酸。TrTLR21和TrTLR22蛋白均具有信号肽和富含亮氨酸重复基序(leucine-rich repeat,LRR)的胞外结构域、跨膜域和胞内结构域(Toll/IL-1 reporter,TIR),符合TLRs的典型特征,TrTLR21和TrTLR22的LRR基序数目不同,TrTLR21具有4个LRR-TYP基序和14个LRR基序,而TrTLR22有3个LRR-TYP基序,有13个LRR基序和1个LRR-CT基序。氨基酸同源性和系统进化树分析,TrTLR21和TrTLR22氨基酸序列与其它鱼类的氨基酸序列同源性分别在53.1%-81.8%和41.3%-82%之间,均与黄尾鲫(Seriola Lalandi)聚为一枝。TrIRAK1和TrTRAF3开放阅读框分别为2247 bp和1788 bp,分别推定编码748和595个氨基酸。TrIRAK1蛋白含有死亡结构域(death domain,DD)和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(Serine/Threonine protein kinases catalytic domain,S-TKc);TrTRAF3蛋白具有环指结构域(RING domain)、锌指结构(zinc fingers)、卷曲螺旋结构(coiled-coil region,CCR)和MATH结构域。TrIRAK1和TrTRAF3氨基酸序列与其他鱼类氨基酸序列同源性分别在44.7%-76.1%和74.7%-93.9%之间。系统发育树显示TrIRAK1与红笛鲷(Lutjanus sanguineus)亲缘关系最近,TrTRAF3和高体鲫(Seriola dumerili)聚为一枝。结果表明,TrTLR21、TrTLR22、TrTRAF3和TrIRAK1在物种进化过程中高度保守。2.TrTLR21、TrTLR22、TrTRAF3和TrIRAK1在健康卵形鲳鲹的组织中呈组成型表达,但在不同的组织中表达水平具有明显差异。TrTLR21在脾脏中表达量最高,其次为头肾、皮肤、心脏、肠和鳃,在肌肉的表达量最低;TrTLR22在头肾中表达量最高,其次为脾脏、鳃和肠,在心脏的表达最低;TrIRAK1在鳃中表达量最高,其次为皮肤、脑、脾脏、肝脏和头肾,在肌肉的表达最低;TrTRAF3在脾脏中表达量最高,其次为肝脏和头肾,在肌肉的表达最低。3.溶藻弧菌、LPS 和 Poly1:C 刺激后,TrTLR21、TrTLR22、TrTRAF3和TrIRAK1的表达水平在脾脏、头肾等免疫器官中均呈上调现象,但在不同组织中和不同时间点上调水平存在差异。LPS刺激后,TrTLR21、TrTLR22和TrIRAK1在脾脏中表达水平分别在24 h、6 h和24 h达到峰值,而TrTRAF3在鳃中的表达水平在24 h达到峰值。溶藻弧菌刺激后,TrTLR21、TrTLR22和TrTRAF3在脾脏表达水平分别在24 h、6 h和12 h达到峰值;TrIRAK1在肝脏中表达水平在12 h达到峰值。polyI:C刺激后,TrTLR21、TrTLR22和TrIRAK1在肝脏的表达水平高分别在24 h、6 h和6 h达到峰值,而TrTRAF3在脾脏中的表达水

关键词：卵形鲳鲹 TLR21 TLR22 TRAF3 IRAK1 表达分析

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卵形鲳鲹仔稚鱼异速生长的研究

水产科学 2017年第3期36卷 259-266页

作者：杨其彬马振华程大川江世贵李有宁陈明强中国水产科学研究院南海水产研究所广东广州510300 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室广东广州510300 南京农业大学无锡渔业学院江苏无锡214081

以传统的理论生物学研究方法,对孵化后卵形鲳鲹1~36日龄仔、稚鱼各器官测量和分析,研究其在早期环境适应上的异速生长及其生态学含义,以期为卵形鲳鲹的人工繁殖、育苗提供参考。试验结果表明,卵形鲳鲹仔、稚鱼的感觉、呼吸、摄食和游泳... 详细信息

以传统的理论生物学研究方法,对孵化后卵形鲳鲹1~36日龄仔、稚鱼各器官测量和分析,研究其在早期环境适应上的异速生长及其生态学含义,以期为卵形鲳鲹的人工繁殖、育苗提供参考。试验结果表明,卵形鲳鲹仔、稚鱼的感觉、呼吸、摄食和游泳等器官快速分化,均存在异速生长现象。在头部器官中,吻长、口宽、眼径和头高在仔鱼期均为正异速生长,稚鱼期头高为等速生长,吻长、眼径和口宽为负异速生长。在身体各部位中,仔鱼期头长、体高和尾长为正异速生长,躯干长为负异速生长;稚鱼期各部分皆为等速生长;在游泳器官中,仔鱼期卵形鲳鲹胸鳍长、尾鳍高和臀鳍长为正异速生长,尾鳍长为等速生长,背鳍长为负异速生长;稚鱼期背鳍长和臀鳍长为正异速生长,胸鳍长、尾鳍长和尾鳍高为等速生长。卵形鲳鲹这些关键部位的快速发育,使外源性营养开始后以最小的代谢损耗获得了生存能力的显著提升,对适应复杂的生存压力具有重要的生态学意义。

关键词：卵形鲳鲹早期发育仔、稚鱼异速生长