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卵圆细胞恶性转化相关差异性甲基化基因的筛选及验证

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安徽医药 2020年第12期24卷 2359-2364页

作者：汪鑫闫亮亮安然程亚王恒毅安徽医科大学第一附属医院急诊外科安徽合肥230032 安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科安徽合肥230032

目的通过对卵圆细胞恶性转化相关差异性甲基化基因的筛选及验证,初步探索卵圆细胞发生恶性转化的表观遗传学调控机制。方法利用简化甲基化测序(Reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)对转染肝细胞癌基因HBV X(HBX)发生恶... 详细信息

目的通过对卵圆细胞恶性转化相关差异性甲基化基因的筛选及验证,初步探索卵圆细胞发生恶性转化的表观遗传学调控机制。方法利用简化甲基化测序(Reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)对转染肝细胞癌基因HBV X(HBX)发生恶性转化的卵圆细胞(HBX⁃LE6)与正常大鼠肝卵圆细胞(LE6)进行甲基化测序,获得差异性甲基化区域(Differen⁃tially methylated region,DMR)与相关差异性甲基化基因(Differentially methylated gene,DMG),通过实时定量聚合酶链反应(Real⁃time qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)、甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)进行检测,验证甲基化对DMG表达的调控作用。结果共筛选相关DMR 1434个,其中高甲基化DMR 623个(位于启动子128个);低甲基化DMR 811个(位于启动子216个),DMG共1987个。挑选启动子均存在高甲基化DMR的相关基因如泛素特异性蛋白酶18基因(USP18)、有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶6(MAP3K6)、SWI/SNF染色质重塑复合物(SMARCB1)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤抑制因子(CYLD)、环指蛋白39(RNF39)、含16的锌指和BTB结构域蛋白(ZBTB16)、同源异型盒基因D8(HOXD8)进行验证。USP18、SMRCB1、CYLD、ZBTB16在LE6和HBX⁃LE6中的mRNA相对表达量分别为[(4.50±0.43),(2.09±0.18)]、[(7.34±0.11),(2.57±0.29)]、[(7.30±0.27),(3.44±0.13)]、[(7.01±0.06),(1.29±0.32)],与LE6相比,其在HBX⁃LE6中表达显著下调(P0.05)。5⁃Aza⁃CdR对HBX⁃LE6细胞干预后,MSP证实SMARCB1在HBX⁃LE6中的高甲基化被5⁃Aza⁃CdR抑制,其mRNA与蛋白表达水平均显著上调(P卵圆细胞恶性转化的表观遗传学调控机制,DNA高甲基化下调卵圆细胞中抑癌基因SMARCB1可能参与了癌变的过程,但机制仍需要进一步研究明确。

关键词： DNA甲基化卵圆细胞癌,肝细胞基因表达调控,肿瘤泛素特异性蛋白酶类肿瘤抑制蛋白质类受体,表皮生长因子癌基因差异性甲基化区域(DMR) 差异性甲基化基因(DMG)

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卵圆细胞在实验性肝癌发生过程中的演变特征

癌症 2007年第7期26卷 719-723页

作者：陈琼荣向锦廖冰刘青波车丽洪薛玲赵国强中山大学中山医学院病理学教研室华南肿瘤学国家重点实验室

背景与目的:卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用至今还不十分明了。本研究拟通过动态的方法观察卵圆细胞在肝癌发生过程中的演变规律,揭示卵圆细胞与肝癌发生之间的关系。方法:构建实验性肝癌的大鼠诱癌模型,运用常规HE染色、免疫组织化学... 详细信息

背景与目的:卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用至今还不十分明了。本研究拟通过动态的方法观察卵圆细胞在肝癌发生过程中的演变规律,揭示卵圆细胞与肝癌发生之间的关系。方法:构建实验性肝癌的大鼠诱癌模型,运用常规HE染色、免疫组织化学和爱新蓝特殊染色等方法,动态观察卵圆细胞在肝癌发生过程中的演变规律。结果:HE和免疫组化结果显示,在诱癌的第4周即可见散在的卵圆细胞在门管区附近出现,卵圆细胞OV-6免疫染色呈阳性。在诱癌的第8周和第14周,OV-6阳性细胞逐渐增多,并向肝小叶实质内深入,将肝组织分割成假小叶状。到诱癌的第17周和第24周,多个癌灶出现,同时OV-6阳性细胞的总体数量下降,癌灶内可观察到OV-6阳性细胞。爱新蓝特殊染色显示,诱发的肿瘤属混合性肝癌,其中胆管上皮细胞癌爱新蓝染色呈阳性,肝细胞癌染色呈阴性。结论:卵圆细胞在肝癌的发生过程中可能扮演重要的角色。

关键词：肝肿瘤/病理学实验性肝癌卵圆细胞大鼠

人乙肝肝硬化组织中Wnt1的表达对肝卵圆细胞介导肝脏再生的影响

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人乙肝肝硬化组织中Wnt1的表达对肝卵圆细胞介导肝脏再生的影响

作者：樊爽内蒙古医科大学

学位级别：硕士

背景及目的:肝脏主要依靠肝细胞的自我再生和肝内干细胞的增殖分化两大途径修复受损的肝脏。肝卵圆细胞是具有多分化潜能的干细胞,它在正常肝脏中处于静息状态,但是在肝硬化组织中被激活同时具有修复肝脏和促进肝硬化发展的双重作用。... 详细信息

背景及目的:肝脏主要依靠肝细胞的自我再生和肝内干细胞的增殖分化两大途径修复受损的肝脏。肝卵圆细胞是具有多分化潜能的干细胞,它在正常肝脏中处于静息状态,但是在肝硬化组织中被激活同时具有修复肝脏和促进肝硬化发展的双重作用。肝卵圆细胞在介导肝脏再生的过程中受到多种信号分子及其通路精确的调控。其中Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育的许多阶段以及肝脏发育中控制着各种分化途径,在成体的肝脏中能维持肝脏的稳态和再生修复。Wnt1信号蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路既可以调控肝卵圆细胞的增殖和分化,也可以调控肝细胞的自我再生过程。本研究的目的通过分析在肝硬化代偿期中肝卵圆细胞介导肝脏再生的作用,探讨Wnt1的表达对肝卵圆细胞介导肝脏再生的影响。方法:收集50例从2018年12月至2020年12月在内蒙古医科大学附属医院外科手术切除的Child—Pugh A级乙肝肝细胞肝癌的癌旁肝硬化组织标本。采用HE染色观察,并且行免疫组织化学法对Wnt1、肝卵圆细胞和增殖的肝细胞进行染色观察。根据HE染色观察的结果依据Laennec肝硬化分级标准对肝硬化程度进行分组,比较不同肝硬化程度组间肝卵圆细胞数以及增殖的肝细胞数的差异,并分析肝硬化程度与肝卵圆细胞数以及增殖的肝细胞数之间的相关性。根据Wnt1免疫组化染色的结果依据其表达的高低进行分组,比较不同Wnt1表达程度组间肝卵圆细胞数以及增殖的肝细胞数的差异,并分析Wnt1表达程度与肝卵圆细胞数以及和增殖的肝细胞数之间的相关性。分别以肝卵圆细胞数和增殖的肝细胞数为因变量,采用多元线性回归分析肝硬化程度和Wnt1表达程度分别对肝卵圆细胞数和增殖的肝细胞数的影响。结果:1.肝硬化程度分组按照Laennec肝硬化分级系统标准,轻度肝硬化组织31例,中度肝硬化组织19例。Wnt1表达程度分组按照半定量积分=染色强度评分×阳性细胞数评分的标准,Wnt1低表达27例,Wnt1高表达23例。2.轻度肝硬化组织中肝卵圆细胞数3.05±1.08个/mm,中度肝硬化组织中肝卵圆细胞数4.99±1.65个/mm,两组比较具有统计学意义(P细胞数2.07±1.07个,中度肝硬化组织中Ki-67阳性的肝细胞数1.30±0.72个,两组比较具有统计学意义(P卵圆细胞数2.74±0.88个/mm,Wnt1高表达组中肝卵圆细胞数为5.01±1.41个/mm,两组比较具有统计学意义(P细胞数2.16±1.07个,Wnt1高表达组中Ki-67阳性的肝细胞数为1.33±0.76个,两组比较具有统计学意义(P卵圆细胞数呈正相关(r=0.522;P细胞数呈负相关(-0.357;P卵圆细胞数呈正相关(r=0.737;P细胞数呈负相关(r=-0.395;P卵圆细胞数和Ki-67阳性的肝细胞数为因变量,以肝硬化程度和Wnt1表达程度为自变量,进行多元线性回归分析。肝卵圆细胞数的影响因素多元线性回归分析(模型R=0.713,调整R=0.701;对回归模型检验F=58.508,P卵圆细胞数均有影响,根据其标准回归系数的绝对值大小,得出Wnt1表达程度对肝卵圆细胞数的影响程度高于肝硬化程度对其的影响。Ki-67阳性的肝细胞数影响因素多元线性回归分析(模型R=0.256,调整R=0.224;对回归模型检验F=8.084,P细胞数均有影响,根据其标准回归系数的绝对值大小,得出Wnt1表达程度对Ki-67阳性的肝细胞数的影响程度高于肝硬化程度对其的影响。结论:1.在肝硬化代偿期中,随着肝硬化程度的增加,肝细胞自我再生受到抑制,肝卵圆细胞可能是介导肝脏再生的主要来源。2.在肝硬化代偿期中,随着肝硬化组织中Wnt1表达程度的增加,肝细胞自我再生受到抑制,Wnt1表达可能主要通过激活肝卵圆细胞的Wnt信号转导通路促进肝脏再生。3.Wnt1表达程度对肝卵圆细胞介导肝脏再生的影响程度高于肝硬化程度对其的影响,提示肝硬化程度的变化可能是肝卵圆细胞介导肝脏再生的前提条件,Wnt1表达对肝卵圆细胞介导肝脏再生发挥着较大的作用。

关键词：肝硬化卵圆细胞肝脏再生 Wnt信号转导通路干细胞

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卵圆细胞参与实验性肝癌形成过程的研究

中华外科杂志 2004年第5期42卷 291-295页

作者：龚加庆方驰华李雅田伏洲成都军区总医院全军普外中心 610083 第一军医大学珠江医院肝胆外科成都军区总医院内四科 610083

目的　探讨卵圆细胞在肝组织内的起源及其与原发性肝细胞肝癌的关系。方法　清洁型SD大鼠 6 0只 ,随机分为正常组 (2 0只 )和实验组 (40只 ) ,各组于开始制造肝癌模型后的不同时段取肝组织标本进行常规病理和C kit、PCNA免疫组化检测。... 详细信息

目的　探讨卵圆细胞在肝组织内的起源及其与原发性肝细胞肝癌的关系。方法　清洁型SD大鼠 6 0只 ,随机分为正常组 (2 0只 )和实验组 (40只 ) ,各组于开始制造肝癌模型后的不同时段取肝组织标本进行常规病理和C kit、PCNA免疫组化检测。结果　正常组大鼠肝脏表面光滑 ,组织学形态正常 ,偶见C kit和PCNA阳性细胞 ;实验组于肝脏染毒的第 2周 ,首先于汇管区发现卵圆细胞沿胆管上皮依次排列增生 ,这些卵圆细胞呈C kit和PCNA阳性表达。随着染毒加重 ,卵圆细胞以汇管区为中心向肝小叶穿插生长。肝癌形成时 ,癌结节内外均见有卵圆细胞聚集 ,此期C kit阳性细胞仍以汇管区为主 ,而PCNA阳性细胞遍布癌结节内外。结论　卵圆细胞起源于汇管区的胆管上皮 ;卵圆细胞与肝癌的发生密切相关。

关键词：卵圆细胞实验性肝癌形成过程免疫组织化学干细胞

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卵圆细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞

中国组织工程研究与临床康复 2008年第21期12卷 4007-4011页

作者：缴富斌张波孙晓艳罗军季建华解放军军医进修学院北京市100853 解放军总参警卫局保健处北京市100017 解放军总医院基础医学研究部北京市100853

背景:原代分离的肝卵圆细胞具有双向分化的能力和横向分化的可塑性。目的:分离大鼠肝脏卵圆细胞,在化学诱导剂作用下使其定向分化为胰岛素分泌细胞。设计、时间及地点:对照观察细胞实验,于2007-05/2008-01在解放军总医院基础研究部,国... 详细信息

背景:原代分离的肝卵圆细胞具有双向分化的能力和横向分化的可塑性。目的:分离大鼠肝脏卵圆细胞,在化学诱导剂作用下使其定向分化为胰岛素分泌细胞。设计、时间及地点:对照观察细胞实验,于2007-05/2008-01在解放军总医院基础研究部,国家重点实验室完成。材料:SPF级SD大鼠,体质量(120±20)g。方法:采用改良梯度离心法分离、培养大鼠肝卵圆细胞,并行免疫组织化学鉴定。随后将卵圆细胞置于含有诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖的RPMI1640培养液继续培养,同时以不含诱导剂的RPMI1640培养液培养的卵圆细胞作为阴性对照。主要观察指标:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附实验、放射免疫分析检测两组卵圆细胞胰岛素的表达。结果:改良的梯度离心方法分离的细胞具干细胞特点,可形成集落,并且OV6、CD34、Nestin染色呈阳性。分离的大鼠肝卵圆细胞,加入诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖诱导培养1周后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附、RIA检测均显示胰岛素分泌量远高于不含诱导剂细胞(P卵圆细胞可启动胰十二指肠同源盒基因-l基因,使之定向分化为胰岛素分泌细胞。

关键词：肝脏干细胞卵圆细胞 PDX-1 梯度离心 RIA

肝卵圆细胞活化的微环境及其与肝纤维化关系的研究进展

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中华肝胆外科杂志 2019年第5期25卷 386-389页

作者：廖渭高毅彭青张鹏南方医科大学珠江医院肝胆二科广州510280 广州医科大学附属第二医院器官移植中心广州510280

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段,严重威胁着我国人民健康。卵圆细胞位于肝脏汇管区,具有多向分化潜能,在肝纤维化中扮演重要角色。卵圆细胞具有促纤维化和抗纤维化的双重作用,其活化、分化和迁移等与肝纤维化关系密... 详细信息

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段,严重威胁着我国人民健康。卵圆细胞位于肝脏汇管区,具有多向分化潜能,在肝纤维化中扮演重要角色。卵圆细胞具有促纤维化和抗纤维化的双重作用,其活化、分化和迁移等与肝纤维化关系密切。深入研究卵圆细胞的生物学特性及微环境调控机制,将为肝纤维化的治疗提供新策略。本文就卵圆细胞活化的微环境及其与肝纤维化的关系进行综述。

关键词：纤维化细胞微环境干细胞肝星状细胞卵圆细胞

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体外大鼠肝卵圆细胞的长期培养方法

中国组织工程研究 2014年第29期18卷 4663-4668页

作者：尹寿新周震马美雪杨景波羊东晔中南大学湘雅二医院消化内科湖南省长沙市410011 长沙市第一医院消化内科湖南省长沙市410005 徐州市中心医院消化内科江苏省徐州市221009

背景:肝卵圆细胞是目前公认的成体肝干/祖细胞,但其体外长期培养时会不可避免地丢失干细胞的活性。目的:探索大鼠肝卵圆细胞体外长期培养的方法。方法:构建2-乙酰胺基芴/部分肝切除肝再生大鼠模型,通过酶消化和Percoll梯度离心分离纯化... 详细信息

背景:肝卵圆细胞是目前公认的成体肝干/祖细胞,但其体外长期培养时会不可避免地丢失干细胞的活性。目的:探索大鼠肝卵圆细胞体外长期培养的方法。方法:构建2-乙酰胺基芴/部分肝切除肝再生大鼠模型,通过酶消化和Percoll梯度离心分离纯化大鼠异质卵圆细胞并进行免疫染色鉴定,用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外长期培养,后撤去表皮生长因子、白血病抑制因子,通过形态学的观察和分子标志物的检测判断其能否保持干/祖细胞活性。结果与结论:采用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外培养卵圆细胞4个月后,大鼠异质卵圆细胞仍能表达肝细胞标志物ALB、胆管上皮细胞标志物CK-19,经不含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养液继续培养后,卵圆细胞胎肝标志AFP表达量迅速下降。该研究结果表明大鼠肝卵圆细胞在表皮生长因子、白血病抑制因子等培养条件下可长期增殖并保持干细胞活性。

关键词：肝细胞表皮生长因子白血病抑制因子细胞,培养的组织构建组织工程卵圆细胞长期培养国家自然科学基金

肝星状细胞诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化的体外研究

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中华肝脏病杂志 2009年第10期17卷 765-770页

作者：陈琳陈孝平张伟梁慧芳林有智董汉华周巧丹华中科技大学附属同济医院肝脏外科中心武汉430030

目的研究肝星状细胞（HSC）在体外培养的卯圆细胞向成熟肝细胞分化过程中所起的作用。方法（1）将卯圆细胞分别与原代培养的HSC混合共培养（混合共培养组），采用Millicell小室不接触共培养（不接触共培养组），卵圆细胞单独培养作为对... 详细信息

目的研究肝星状细胞（HSC）在体外培养的卯圆细胞向成熟肝细胞分化过程中所起的作用。方法（1）将卯圆细胞分别与原代培养的HSC混合共培养（混合共培养组），采用Millicell小室不接触共培养（不接触共培养组），卵圆细胞单独培养作为对照组。在共培养后第7、14、21天观测，采用Western blot和荧光定量PCR检测肝细胞核因子4α（HNF-4α）、白蛋白和甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达量；（2）电子透射显微镜观察卵圆细胞超微结构的变化；（3）过碘酸希夫染色检测各时间点卵圆细胞内糖原颗粒的含量；（4）酶联免疫吸附法检测各时间点卵圆细胞分泌白蛋白的含量。统计学处理采用重复测量资料的多因素方差分析和LSD—t检验。结果（1）卵圆细胞第7、14、21天表达HNF-4α和白蛋白的mRNA的量（相对与共培养之前的表达量的倍数）：混合共培养组HNF-4α分别为（1．9±0．2）倍、（10．7±1．2）倍、（12．0±1．3）倍；白蛋白mRNA的量分别为（5．7±1．6）倍、（110．7±13．7）倍、（173．6±22．3）倍；不接触共培养组HNF-4α分别为（1．4±0．1）倍、（3．2±0．6）倍、（8．9±1．4）倍；白蛋白mRNA的量分别为（2．9±1．4）倍、（22．3±8．5）倍、（96．3±16．3）倍。共培养组（混合共培养与不接触共培养组）的表达量均高于对照组，LSD-t值分别为32．98，10．08；13．38，7．96；P值均〈0．01，差异有统计学意义。第7、14、21天AFP、CK-19的表达量：混合共培养组AFP分别为（1．1±0．2）倍、（0．2±0．0）倍、（0．0±0．0）倍；CK-19分别为（0．2±0．1）倍、（0．0±0．0）倍、（0．0±0．0）倍；不接触共培养组AFP分别为（1．0±0．2）倍、（0．2±0．1）倍、（0．1±0．0）倍；CK-19分别为（0．6±0．1）倍、（0．1±0．0）倍、（0．0±0．0）倍。共培养组（混合共培养与不接触共培养组）的表达量均低于对照组。LSD—t值分别为37．99，34．50；13．59，22．46；P值均〈0．01，差异有统计学意义。（2）卵圆细胞共培养后白蛋白分泌量明显增加：混合共培养组：14d为（15．30±0．09）ng／ml、21d（20．98±0．12）ng／ml；不接触共培养组14d为（11．41±0．13）ng／ml，21d为（15．12±0．17）ng／ml，混合共培养组高于不接触共培养组，LSD—t=251．94，P〈0．01，差异有统计学意义。（3）随着共培养时间的延长，卯圆细胞内质网、线粒体和高尔基体等细胞器逐渐丰富，且细胞间形成毛细胆管结构。（4）过碘酸希夫染色显示共培养后卵圆细胞内出现大量红色糖原颗粒。结论HSC可以诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化，HSC除了通过细胞因子等可溶性因子途径发挥作用外，与卵圆细胞的直接接触也有着重要作用。

关键词：肝细胞白蛋白类甲胎蛋白类肝星状细胞卵圆细胞

HBx基因诱导肝卵圆细胞恶性转化并促进其发生侵袭转移

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华中科技大学学报（医学版） 2017年第4期46卷 410-413页

作者：刘顺芳董可帅张尊义董汉华华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科武汉430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院肝脏外科武汉430030

目的研究HBx对肝卵圆细胞发生恶性转化并上皮-间质转化(EMT)的影响。方法以稳定表达HBx的转基因卵圆细胞株pEGFP-HBx-LE/6为实验组,pEGFP-LE/6卵圆细胞为对照组。使用Western blotting、Transwell细胞侵袭实验、划痕实验、CCK-8等检测pE... 详细信息

目的研究HBx对肝卵圆细胞发生恶性转化并上皮-间质转化(EMT)的影响。方法以稳定表达HBx的转基因卵圆细胞株pEGFP-HBx-LE/6为实验组,pEGFP-LE/6卵圆细胞为对照组。使用Western blotting、Transwell细胞侵袭实验、划痕实验、CCK-8等检测pEGFP-HBx-LE/6在细胞周期、分化标志物以及增殖转移能力方面的变化。结果(1)实验组细胞体积增大、具有明显异形性,CK-19、CK-7表达明显下降,AFP、HNF-4α表达升高;(2)实验组细胞的增殖能力明显升高,克隆形成能力、侵袭能力、划痕恢复能力明显增强;(3)与对照组比较,实验组E-cadherin表达水平明显下降,而N-cadherin、α-SMA、Vimentin表达水平明显上升。结论 HBx基因可诱导肝卵圆细胞向恶性转化,并促进其转移。

关键词：卵圆细胞 HBx 上皮-间质转化