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Purα对匹罗卡品致痫大鼠海马DNA损伤的保护作用

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中华医学杂志 2015年第27期95卷 2214-2218页

作者：刘强孙涛杨征宋祖耀和祯泉王峰牛建国崔建奇宁夏医科大学总医院神经外科银川750004 宁夏颅脑疾病重点实验室

目的探讨Purα蛋白对匹罗卡品诱导癫痫大鼠海马所致DNA损伤的保护作用，以及Purα蛋白在DNA损伤修复中的作用。方法将Purα蛋白过表达的慢病毒和Purα siRNA慢病毒在立体定位仪指导下注入大鼠海马组织。注入后14d通过荧光切片和免疫印... 详细信息

目的探讨Purα蛋白对匹罗卡品诱导癫痫大鼠海马所致DNA损伤的保护作用，以及Purα蛋白在DNA损伤修复中的作用。方法将Purα蛋白过表达的慢病毒和Purα siRNA慢病毒在立体定位仪指导下注入大鼠海马组织。注入后14d通过荧光切片和免疫印迹证实病毒已经在海马组织表达，然后用匹罗卡品腹腔注射诱导癫痫发作。癫痫发作1h后处死动物，分别取样进行免疫组织化学和免疫印迹检测与DNA损伤和修复。结果免疫组织化学结果表明，DNA损伤标志性蛋白γH2AX在大鼠CA1区的表达，各组选20张相同背景色的海马CA1区通过图像分析软件iPP6．0测定阳性细胞的平均光密度值；与空载组（0．40±0．11）和对照组（0．42±0．05）相比，Purα过表达组（0．15±0．10）免疫着色阳性细胞数目明显减少（P〈0．01）；而在Purα沉默组（0．68±0．06）明显增高（P〈0．01）。免疫印迹结果表明，在DNA损伤修复相关蛋白Parp-1的表达上：与空载组（0．93±0．11）和对照组（1．00±0．00）相比，Purα过表达组（0．17±0．09）的表达明显降低（P〈0．01）；Purα沉默组的表达明显增高（P〈0．01）。结论癫痫发作早期可引起明显的DNA损伤，Purα蛋白对癫痫引起的DNA损伤有明显的保护作用。

关键词：癫痫人转录因子活性蛋白α 匹罗卡品

G蛋白偶联雌激素受体1对颞叶癫痫大鼠发作易感性的影响

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中华神经医学杂志 2021年第7期20卷 656-661页

作者：左娣文玉军任晓璠丁娜路光远马琳和祯泉牛建国宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室银川750004 宁夏医科大学药学院银川750004

目的探讨G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)特异性激动剂G1、拮抗剂G15对癫痫大鼠发作易感性的影响。方法将60只大鼠按随机数字表法分为对照组、G1处理组、G15处理组,每组20只。后2组大鼠分别腹腔注射GPER1特异激动剂G1(10μg)、拮抗剂G15(40... 详细信息

目的探讨G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)特异性激动剂G1、拮抗剂G15对癫痫大鼠发作易感性的影响。方法将60只大鼠按随机数字表法分为对照组、G1处理组、G15处理组,每组20只。后2组大鼠分别腹腔注射GPER1特异激动剂G1(10μg)、拮抗剂G15(40μg),连续注射12 d。3组大鼠均制备氯化锂-匹罗卡品癫痫模型。观察大鼠腹腔注射匹罗卡品后1 h内的行为学表现,每隔5分钟采用Racine分级评估癫痫发作严重程度,比较3组大鼠癫痫发作(Racine分级Ⅳ级)的潜伏期和不同时间点癫痫发作级别。使用脑电监测系统监测大鼠脑电图,记录匹罗卡品注射前10 min到注射后2 h的脑电数据,采用傅立叶变换(FFT)进行脑电的时频分析。比较3组大鼠脑电能量值的分布和癫痫持续状态20 min内θ、α波能量值的变化。结果(1)与对照组、G1处理组比较,G15处理组大鼠的癫痫发作潜伏期明显缩短,差异均有统计学意义(P匹罗卡品后15 min、20 min,G1处理组大鼠癫痫发作分级较对照组低,差异均有统计学意义(P匹罗卡品后15~35 min,G15处理组大鼠癫痫发作分级较对照组高,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)与对照组比较,G1处理组大鼠癫痫发作时脑电波幅较小,而G15处理组大鼠癫痫发作时间较早,且脑电波幅大、频率高。与对照组比较,G1处理组大鼠的脑电能量值变化不明显,而G15处理组大鼠在2 h内呈现出更高的脑电能量值。与对照组和G1处理组比较,G15处理组大鼠在癫痫持续状态20 min内θ、α波能量值明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论GPER1的活性水平与癫痫发作易感性有关,特异性抑制GPER1活性可增强癫痫易感性,增大癫痫过程中特定频率波段的能量值。

关键词： G蛋白偶联雌激素受体1 癫痫匹罗卡品 G1 G15

TRPM7参与调控匹罗卡品诱导的癫痫体内外模型的凋亡

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TRPM7参与调控匹罗卡品诱导的癫痫体内外模型的凋亡

作者：何苗中国医科大学

学位级别：硕士

目的:癫痫（epilepsy）是由大脑神经元异常放电引发的慢性脑部疾病,其病因十分复杂,目前尚未阐明。癫痫发病机制复杂,常伴有神经元死亡。细胞凋亡是一种由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶介导的程序性细胞死亡。以往研究已发现凋亡在癫痫患者和... 详细信息

目的:癫痫（epilepsy）是由大脑神经元异常放电引发的慢性脑部疾病,其病因十分复杂,目前尚未阐明。癫痫发病机制复杂,常伴有神经元死亡。细胞凋亡是一种由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶介导的程序性细胞死亡。以往研究已发现凋亡在癫痫患者和癫痫动物模型中发生;抑制癫痫动物模型大脑的凋亡可减少海马神经元的丢失和癫痫的自发性反复发作。瞬时受体电位通道7（transient receptor potential melastatin 7,TRPM7）是位于细胞膜上的一组非选择性阳离子通道,广泛表达于神经系统。TRPM7蛋白在匹罗卡品（pilocarpine,PILO）诱导的癫痫大鼠脑中表达增加,抑制TRPM7活性可以减少神经细胞死亡,然而,目前对TRPM7在PILO体外模型中的变化尚未阐明。本研究旨在阐明TRPM7在PILO诱导的癫痫模型与凋亡的关系,为癫痫发病机制靶点的探寻提供新角度与新思路。。研究方法:1.应用CCK-8试剂盒检测不同浓度的PILO处理小鼠脑神经瘤（Neuro-2A,N2a）细胞24小时后,细胞活力的变化,确定PILO处理N2a细胞的给药浓度。2.应用Western blot技术检测PILO处理N2a细胞0、8、16、24和48小时后,凋亡相关指标caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白表达的变化,确定PILO处理N2a细胞的给药时间,建立PILO诱导的癫痫N2a细胞模型。3.应用实时定量RT-PCR技术检测PILO的N2a细胞模型中的TRPM7 m RNA表达情况。4.应用Western Blot技术,采用TRPM7基因干扰,TRPM7过表达和TRPM7抑制剂三种方式在PILO诱导的癫痫N2a细胞模型中探究TRPM7与凋亡的关系,并采用TRPM7抑制剂在PILO诱导癫痫小鼠模型中探究TRPM7与凋亡的关系。5.应用TUNEL检测试剂盒在PILO诱导的癫痫N2a细胞模型中确认TRPM7与凋亡的关系。结果:1.不同浓度的PILO处理N2a细胞24小时细胞的活力变化为:随着浓度升高,N2a细胞活力下降,IC50值为20 mM。2.以20 mM作为PILO处理N2a细胞的给药浓度,Western blot结果显示,与处理0小时相比,PILO处理N2a细胞24小时后caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白表达增加,确定PILO处理N2a细胞的给药时间为24小时,确立PILO诱导的癫痫N2a细胞模型的给药方法为20 mM PILO处理24小时。3.以20 mM PILO处理N2a细胞24小时,实时定量RT-PCR结果显示,与对照组相比,PILO处理的体外癫痫N2a细胞模型中TRPM7 m RNA水平增加。4.Western Blot结果显示,与PILO组相比,PILO处理的TRPM7过表达的N2a细胞中,caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白水平进一步增加;PILO处理的TRPM7干扰的N2a细胞中,caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白水平降低;PILO处理的TRPM7抑制剂的N2a细胞中,caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白水平降低。与PILO组相比,PILO处理的TRPM7抑制剂的小鼠海马组织中,caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白水平降低。5.TUNEL染色结果显示,与PILO组相比,PILO+TRPM7过表达组中的细胞凋亡率进一步增加;PILO+si RNA干扰组中的细胞凋亡率降低;PILO+NS8593组中的细胞凋亡率降低。结论:1.PILO在N2a细胞中的IC50为20 mM。2.PILO（20 mM）处理N2a细胞24小时,凋亡发生。3.PILO（20 mM）处理N2a细胞24小时,TRPM7m RNA表达增加。4.TRPM7调控PILO体内外癫痫模型的凋亡。本研究在细胞和动物层面揭示了在癫痫中TRPM7参与调控凋亡发生,为癫痫的发病机制与药物治疗奠定了理论基础与实验依据。

关键词：匹罗卡品瞬时受体电位通道细胞凋亡癫痫离子通道

匹罗卡品癫痫模型恐惧记忆减退的电生理学变化

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上海交通大学学报（医学版） 2009年第2期29卷 135-138页

作者：张玥蔡国恩杨茜李胜天陆钦池上海交通大学医学院仁济医院神经内科上海200001 上海交通大学神经科学研究所上海200030

目的探讨匹罗卡品诱导的癫痫小鼠模型恐惧记忆减退的机制以及电生理学的变化。方法建立腹腔注射微量匹罗卡品(PILO)诱发的颞叶癫痫小鼠模型,对致痫后24 h、2周和6周的小鼠海马切片CA1区域的神经元分别进行α-氨基-3-羧基-5-甲基异戊唑-4... 详细信息

目的探讨匹罗卡品诱导的癫痫小鼠模型恐惧记忆减退的机制以及电生理学的变化。方法建立腹腔注射微量匹罗卡品(PILO)诱发的颞叶癫痫小鼠模型,对致痫后24 h、2周和6周的小鼠海马切片CA1区域的神经元分别进行α-氨基-3-羧基-5-甲基异戊唑-4-丙酸(AMPA)受体介导的基础突触传递效率及长时程增强(LTP)形成的检测;以腹腔注射生理盐水的小鼠为对照组。结果与对照组相比,PILO诱发的癫痫早期(24 h)海马CA1神经元上AMPA受体介导的基础突触传递效率明显增高,LTP呈现增强的趋势(P>0.05);后期(6周)AMPA受体介导的基础突触传递效率与对照组已无明显差别,但LTP的形成被抑制(P<0.05)。结论LTP的抑制是场景恐惧记忆减退的发生机制。

关键词：癫痫匹罗卡品学习记忆海马场电位长时程增强

匹罗卡品致大鼠癫痫持续状态后海马Puma和CytC的表达变化

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匹罗卡品致大鼠癫痫持续状态后海马Puma和CytC的表达变化

作者：王新林上海交通大学

学位级别：硕士

目的:癫痫是一种常见病,流行病学调查显示其发病率为5‰‰。癫痫发作不仅可引起脑部神经元的坏死或病理性凋亡及神经生物学改变,而且还常引起患者及家属严重的心理障碍。癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)是神经科临床常见的危急重症... 详细信息

目的:癫痫是一种常见病,流行病学调查显示其发病率为5‰‰。癫痫发作不仅可引起脑部神经元的坏死或病理性凋亡及神经生物学改变,而且还常引起患者及家属严重的心理障碍。癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)是神经科临床常见的危急重症,常常导致大脑易损区海马组织的损伤,若得不到及时的缓解和治疗,死亡率很高。研究发现Bcl-2蛋白家族中仅具有BH3结构域的P53上调细胞凋亡调控因子Puma(P53 up-regulated modulator of apoptosis,Puma)蛋白在细胞凋亡途径中发挥了重要的作用。而Cyt C在线粒体外膜渗透性增加的情况下可以释放出来,参与内源性线粒体凋亡途径。Puma和Cyt C对SE后海马神经元的损伤机制研究较少,本实验采用匹罗卡品制作SE大鼠动物模型,探讨SE后24小时Cyt C和Puma在海马组织中的表达情况。方法:成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠62只,随机分成实验组(n=54)和对照组(n=8)。实验组先应用硫酸阿托品以拮抗匹罗卡品的外周胆碱能效应,随后通过匹罗卡品腹腔注射制造癫痫模型,根据大鼠是否发生SE将其分为癫痫持续状态组(SE组)和非癫痫持续状态组(非SE组)。24小时后取大鼠海马组织,HE染色观察海马CA1区神经元的数量,TUNEL染色观察海马神经元的损伤情况。采用Western blot方法测定海马组织中Puma的表达,免疫组织化学方法检测海马组织中Cyt C的含量。运用Pearson相关分析法分析Puma和Cyt C表达的相关性。对照组除匹罗卡品用生理盐水代替外,其余所有操作步骤与实验组相同。结果:54只实验组大鼠中未诱导出SE的有12只,归入非SE组。成功诱导出SE的有42只,成功率为77.8%。42只SE大鼠中24h之内死亡14只,死亡率为33.3%,入SE组28只。对照组和非SE组24小时内均未死亡。SE组大鼠海马CA1区HE染色神经元数量(54.75±3.37)与对照组(103.75±2.12)和非SE组(100.67±2.19)相比,显著减少(p<0.05)。SE组TUNEL阳性神经元数目(25.14±2.77)与对照组(3.25±2.19)和非SE组(3.33±2.02)相比明显增加(p<0.05)。而且可见SE组海马组织Cyt C阳性神经元的含量(14.11±2.38)较对照组(2.88±2.70)和非SE组(4.42±2.19)明显增多(p<0.05)。并可见SE组海马组织Puma蛋白的表达(0.439±0.038)较对照组(0.016±0.003)和非SE组(0.249±0.034)明显增多(p<0.05)。相关性分析显示SE组Puma蛋白的表达和Tunel染色阳性神经元细胞含量之间存在着相关关系(r=0.891,p<0.01);而且,SE组Puma和Cyt C的含量变化具有相关性(r=0.895,P<0.01)。结论:大鼠SE后24h海马神经元出现凋亡,而且Puma蛋白的表达和Tunel染色阳性神经元细胞含量之间存在着正相关关系。Puma和Cyt C在SE大鼠海马组织神经元中的表达含量增加,两者的表达水平成正相关。

关键词：癫痫持续状态匹罗卡品 Puma CytC 大鼠

应用于电阻抗断层成像检测及预测癫痫发作的动物模型

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生物医学工程研究 2022年第1期41卷 89-94页

作者：王蓉梁国华朱文静王蕾西北工业大学医学研究院西安710072

癫痫是由于大脑神经元异常放电导致的神经性疾病。对于难治性癫痫患者的治疗关键是癫痫灶的准确定位,若无法定位,手术治疗将无法开展,因此,临床上亟需一种准确定位癫痫灶的成像技术。电阻抗断层成像(electrical impedance tomography,E... 详细信息

癫痫是由于大脑神经元异常放电导致的神经性疾病。对于难治性癫痫患者的治疗关键是癫痫灶的准确定位,若无法定位,手术治疗将无法开展,因此,临床上亟需一种准确定位癫痫灶的成像技术。电阻抗断层成像(electrical impedance tomography,EIT)是一种新兴的医学成像技术,可以准确定位病变部位,同时EIT已经被证实对于癫痫发作前期的脑血流变化具有较高的敏感性,可能实现对癫痫发作的预测。由于癫痫病灶区位于脑部的特殊性,因此,该研究的开展需要选择合适的动物模型。本文综述了目前已经应用于EIT研究的动物癫痫模型,立足于难治性癫痫发作检测及预测的需求,分析每种模型在EIT研究中的优势与局限性,意在寻找一种适用于EIT检测及预测癫痫发作的动物模型。

关键词：电阻抗断层成像难治性癫痫青霉素海人酸匹罗卡品电刺激模型

葛根素对匹罗卡品致痫大鼠海马神经元的保护性研究

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安徽医科大学学报 2020年第12期55卷 1888-1892页

作者：彭芳胡擎鹏南华大学附属第二医院儿科衡阳421001

目的研究葛根素对匹罗卡品诱导癫痫大鼠海马神经元的保护作用及其可能机制。方法随机将30只成年雄性Wistar大鼠均分为5组:对照组、匹罗卡品组、溶剂组、50 mg/kg葛根素组、25mg/kg葛根素组。采用Nissl染色观察海马CA3区锥体神经元变化;T... 详细信息

目的研究葛根素对匹罗卡品诱导癫痫大鼠海马神经元的保护作用及其可能机制。方法随机将30只成年雄性Wistar大鼠均分为5组:对照组、匹罗卡品组、溶剂组、50 mg/kg葛根素组、25mg/kg葛根素组。采用Nissl染色观察海马CA3区锥体神经元变化;TUNEL法观察葛根素对癫痫诱导的神经元凋亡的影响;检测线粒体膜电位及ROS变化;Western blot检测Bax、Bcl-2、Mito-CytC、Cyto-CytC、Cl-caspase3表达。结果Nissl染色发现葛根素能减轻癫痫诱发的神经元死亡(P匹罗卡品组降低(P匹罗卡品组相比,25、50mg/kg葛根素组线粒体膜电位上升(P匹罗卡品组线粒体ROS水平在8h后开始增加,并在72h达到最大水平(P匹罗卡品组Bax、Cyto-CytC、Cl-caspase3表达升高,而Bcl-2、Mito-CytC表达降低,葛根素干预治疗后Bcl-2、Mito-CytC表达升高,Bax、Cyto-CytC、Cl-caspase3表达降低。结论葛根素对匹罗卡品致癫痫大鼠海马神经元损伤具有保护作用,其机制可能与抑制Bax诱导的线粒体CytC释放而减少细胞凋亡有关。

关键词：葛根素匹罗卡品癫痫海马神经元线粒体

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不同药物诱导的小鼠癫痫模型的差异性研究

浙江大学学报（医学版） 2013年第6期42卷 609-614页

作者：胡琳张华丹陈亚天华男曾玲晖浙江大学城市学院医学院浙江杭州310015

目的:比较ICR小鼠对常用致痫药物匹罗卡品、红藻氨酸以及戊四氮的差异性反应,为ICR品系小鼠用作常规癫痫研究奠定基础。方法:成年雄性ICR小鼠给予不同的药物(匹罗卡品、红藻氨酸、戊四氮)诱发急性痫性发作,在癫痫持续状态发作(SE)2h后终... 详细信息

目的:比较ICR小鼠对常用致痫药物匹罗卡品、红藻氨酸以及戊四氮的差异性反应,为ICR品系小鼠用作常规癫痫研究奠定基础。方法:成年雄性ICR小鼠给予不同的药物(匹罗卡品、红藻氨酸、戊四氮)诱发急性痫性发作,在癫痫持续状态发作(SE)2h后终止,分别于造模后7 d采用Fluro-Jade B染色观察兴奋性神经元死亡和28 d后采用Timm染色检测苔藓纤维发芽状况,并于造模之日起录像监测自发性癫痫的发生。结果:ICR小鼠经匹罗卡品和红藻氨酸给药后均能诱发出典型的SE,癫痫发作与大鼠和C57/BL6小鼠非常类似,给药后逐渐出现凝视、点头、面部及头部抽搐、全身肌阵挛、跌倒,大、小便失禁及流涎,最终发生全身强直-阵挛性发作、癫痫持续状态。两者Timm染色均能观察到明显的苔藓纤维发芽(P品系小鼠能诱发出与大鼠C57/BL6小鼠类似的癫痫,其中匹罗卡品和红藻氨酸模型是理想的慢性颞叶癫痫模型。ICR品系小鼠作为既经济又有效的模型动物,可常规用于药物筛选和癫痫机制研究。

关键词：癫痫/化学诱导毛果芸香碱/药理学戊四唑/药理学红藻氨酸/药理学疾病模型动物匹罗卡品戊四氮苔藓纤维发芽

匹罗卡品诱导颞叶癫癎大鼠海马CA1区代谢型谷氨酸受体1、4、7的表达变化

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上海交通大学学报（医学版） 2010年第4期30卷 394-398页

作者：陆钦池蔡国恩陈生弟上海交通大学医学院瑞金医院神经内科上海200025 上海交通大学医学院仁济医院神经内科上海200127

目的观察匹罗卡品诱导的颞叶癫癎大鼠海马CA1区代谢型谷氨酸受体(mGluR)1、4、7的表达变化。方法 56只SD大鼠随机分为对照组、癫癎状态(SE)2 h组、SE 12 h组、SE 24 h组、SE 72 h组、SE 7 d组和SE 14 d组,每组8只。SE各组腹腔注射325 mg... 详细信息

目的观察匹罗卡品诱导的颞叶癫癎大鼠海马CA1区代谢型谷氨酸受体(mGluR)1、4、7的表达变化。方法 56只SD大鼠随机分为对照组、癫癎状态(SE)2 h组、SE 12 h组、SE 24 h组、SE 72 h组、SE 7 d组和SE 14 d组,每组8只。SE各组腹腔注射325 mg/kg匹罗卡品建立癫癎模型,对照组注射等量生理盐水。采用RT-PCR和免疫组织化学方法检测各组大鼠海马CA1区mGluR1、4、7 mRNA和mGluR1蛋白的表达。结果 RT-PCR检测显示,SE 24 h组mGluR1 mRNA表达较对照组显著降低,而SE 7d组则显著增加(P0.05);SE 12 h组、SE 24 h组、SE72 h组和SE 14 d组mGluR7 mRNA表达较对照组显著降低(P<0.05)。免疫组织化学检测显示,mGluR1蛋白主要存在于细胞膜上,其表达变化规律与mGluR1 mRNA一致。结论 mGluR1、4、7可能参与难治性癫癎的发病过程。

关键词：代谢型谷氨酸受体匹罗卡品 mRNA 癫癎动物模型