TRPM7参与调控匹罗卡品诱导的癫痫体内外模型的凋亡

作     者：何苗 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭凤;徐宏

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：匹罗卡品 瞬时受体电位通道 细胞凋亡 癫痫 离子通道 

摘      要：目的:癫痫（epilepsy）是由大脑神经元异常放电引发的慢性脑部疾病,其病因十分复杂,目前尚未阐明。癫痫发病机制复杂,常伴有神经元死亡。细胞凋亡是一种由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶介导的程序性细胞死亡。以往研究已发现凋亡在癫痫患者和癫痫动物模型中发生;抑制癫痫动物模型大脑的凋亡可减少海马神经元的丢失和癫痫的自发性反复发作。瞬时受体电位通道7（transient receptor potential melastatin 7,TRPM7）是位于细胞膜上的一组非选择性阳离子通道,广泛表达于神经系统。TRPM7蛋白在匹罗卡品（pilocarpine,PILO）诱导的癫痫大鼠脑中表达增加,抑制TRPM7活性可以减少神经细胞死亡,然而,目前对TRPM7在PILO体外模型中的变化尚未阐明。本研究旨在阐明TRPM7在PILO诱导的癫痫模型与凋亡的关系,为癫痫发病机制靶点的探寻提供新角度与新思路。。研究方法:1.应用CCK-8试剂盒检测不同浓度的PILO处理小鼠脑神经瘤（Neuro-2A,N2a）细胞24小时后,细胞活力的变化,确定PILO处理N2a细胞的给药浓度。2.应用Western blot技术检测PILO处理N2a细胞0、8、16、24和48小时后,凋亡相关指标caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白表达的变化,确定PILO处理N2a细胞的给药时间,建立PILO诱导的癫痫N2a细胞模型。3.应用实时定量RT-PCR技术检测PILO的N2a细胞模型中的TRPM7 m RNA表达情况。4.应用Western Blot技术,采用TRPM7基因干扰,TRPM7过表达和TRPM7抑制剂三种方式在PILO诱导的癫痫N2a细胞模型中探究TRPM7与凋亡的关系,并采用TRPM7抑制剂在PILO诱导癫痫小鼠模型中探究TRPM7与凋亡的关系。5.应用TUNEL检测试剂盒在PILO诱导的癫痫N2a细胞模型中确认TRPM7与凋亡的关系。结果:1.不同浓度的PILO处理N2a细胞24小时细胞的活力变化为:随着浓度升高,N2a细胞活力下降,IC50值为20 mM。2.以20 mM作为PILO处理N2a细胞的给药浓度,Western blot结果显示,与处理0小时相比,PILO处理N2a细胞24小时后caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白表达增加,确定PILO处理N2a细胞的给药时间为24小时,确立PILO诱导的癫痫N2a细胞模型的给药方法为20 mM PILO处理24小时。3.以20 mM PILO处理N2a细胞24小时,实时定量RT-PCR结果显示,与对照组相比,PILO处理的体外癫痫N2a细胞模型中TRPM7 m RNA水平增加。4.Western Blot结果显示,与PILO组相比,PILO处理的TRPM7过表达的N2a细胞中,caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白水平进一步增加;PILO处理的TRPM7干扰的N2a细胞中,caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白水平降低;PILO处理的TRPM7抑制剂的N2a细胞中,caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白水平降低。与PILO组相比,PILO处理的TRPM7抑制剂的小鼠海马组织中,caspase 3、Bax和cytochrome C蛋白水平降低。5.TUNEL染色结果显示,与PILO组相比,PILO+TRPM7过表达组中的细胞凋亡率进一步增加;PILO+si RNA干扰组中的细胞凋亡率降低;PILO+NS8593组中的细胞凋亡率降低。结论:1.PILO在N2a细胞中的IC50为20 mM。2.PILO（20 mM）处理N2a细胞24小时,凋亡发生。3.PILO（20 mM）处理N2a细胞24小时,TRPM7m RNA表达增加。4.TRPM7调控PILO体内外癫痫模型的凋亡。本研究在细胞和动物层面揭示了在癫痫中TRPM7参与调控凋亡发生,为癫痫的发病机制与药物治疗奠定了理论基础与实验依据。