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青少年的成人起病型糖尿病家系NEUROD1基因突变的筛查与功能解析

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上海交通大学学报（医学版） 2023年第10期43卷 1255-1261页

作者：张娟葛晓旭张荣蒋伏松蒋燕燕李鸣李甜甜刘婵薇陈亚婷刘丽梅黄淮学院医学院形态学教研室驻马店463000 上海交通大学医学院附属第六人民医院内分泌代谢科上海市糖尿病研究所上海200233 上海交通大学医学院附属同仁医院内分泌代谢科上海200336

目的·筛查青少年的成人起病型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young,MODY)家系中NEUROD1基因突变,分析突变与中国人MODY6发病的相关性及其潜在的致病机制。方法·采用PCR-直接测序法对96例GCK/MODY2、HNF1A/MODY3、HNF1B/MODY5突变阴性的中国MODY先证者进行NEUROD1突变筛查,同时比较96例MODY先证者与100例非糖尿病对照者NEUROD1基因变异的基因型频率。采用从头建模法构建NEUROD1蛋白野生型和突变体的3D结构,采用双荧光素酶报告基因系统检测野生型和突变体蛋白对胰岛素基因转录活性的影响。结果·在一个MODY家系中发现NEUROD1基因杂合错义突变Glu59Gln (NM_002500.5,c.175G>C)。3D结构分析发现,该突变将野生型中带负电荷的Glu59转化为突变中不带电荷的Gln59,导致两个盐桥键Glu59-Arg54和Glu59-Lys88缺失,并形成一个新的氢键Gln59-Arg54。与野生型相比,Glu59Gln突变体的胰岛素基因转录活性下降36.3%(P<0.05)。与非糖尿病对照相比,96例MODY先证者中Ala45Thr (G-A)变异的AA+GA基因型频率显著升高(P=0.002)。结论·Glu59Gln突变改变了NEUROD1蛋白N端的分子构象,导致其胰岛素基因转录活性显著下降,是该家系突变携带者胰岛素分泌缺陷的原因。Ala45Thr变异与MODY6先证者糖尿病发病年龄的提前有关。

关键词：青少年的成人起病型糖尿病 NEUROD1基因 MODY6 Glu59Gln突变功能解析

PR-DUB复合物结构与功能解析——特异性去除核小体H2AK119泛素化的分子机理

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中国科学:生命科学 2023年第9期53卷 1324-1326页

作者：王倪吴旭东天津医科大学基础医学院细胞生物学系天津市医学表观遗传学重点实验室天津300070

细胞类型特异的染色质状态对基因表达程序有非常重要的影响.多梳家族蛋白(polycomb group,PcG)介导的转录抑制性染色质状态是一种重要的表观遗传调控机制,精细调控发育基因的正确时空表达和细胞的命运决定,其失调导致肿瘤等多种疾病[1].... 详细信息

细胞类型特异的染色质状态对基因表达程序有非常重要的影响.多梳家族蛋白(polycomb group,PcG)介导的转录抑制性染色质状态是一种重要的表观遗传调控机制,精细调控发育基因的正确时空表达和细胞的命运决定,其失调导致肿瘤等多种疾病[1].PcG蛋白往往形成复合物调控组蛋白修饰,其中PRC1催化H2AK119单泛素化(H2AK119ub1),PRC2催化H3K27甲基化(H3K27me),PR-DUB去除H2AK119ub1[2].

关键词：性染色质 DUB 功能解析细胞类型转录抑制核小体组蛋白修饰基因表达

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马铃薯CHS基因家族鉴定及功能解析

马铃薯CHS基因家族鉴定及功能解析

作者：王文静安徽农业大学

学位级别：硕士

马铃薯是第四大粮食作物,具有丰富的营养价值,特别是彩色马铃薯中含有大量的花青素,具有较强的抗氧化作用,有益于人体健康。类黄酮是植物中最大的次生代谢物——酚类化合物之一,其种类多样,是天然抗氧化剂。花青素是类黄酮中最大的一类... 详细信息

马铃薯是第四大粮食作物,具有丰富的营养价值,特别是彩色马铃薯中含有大量的花青素,具有较强的抗氧化作用,有益于人体健康。类黄酮是植物中最大的次生代谢物——酚类化合物之一,其种类多样,是天然抗氧化剂。花青素是类黄酮中最大的一类,也被认为是人类饮食中重要的健康促进成分。查尔酮合成酶(CHS)是花青素合成核心阶段的第一个酶,其表达与花青素的生物合成密切相关。然而,CHS基因家族在马铃薯中尚未得到全面的鉴定与分析。为探究马铃薯块茎中色素形成的主要成分及其与抗氧化能力的相关性,明确花青素通路中的关键查尔酮合成酶(CHS),本研究通过生物信息学技术对CHS基因家族进行全基因组鉴定与分析,利用不同时期不同色泽马铃薯材料进行生理指标测定,进而探究马铃薯花青素生物合成中的关键查尔酮合成酶基因(CHS),并解析其生物学功能。研究结果可为马铃薯花青素生物合成的分子机制解析奠定基础,为富含花青素马铃薯育种提供更多的理论依据和新的基因资源。主要研究结果如下:1.马铃薯基因组中共鉴定到12个St CHS基因,可分为3个亚组。染色体定位分析表明这12个成员分布于马铃薯的4条染色体上,基因结构分析表明多数St CHS基因含有2个外显子和1个内含子。不同组织表达模式分析表明多数St CHS基因在叶片、块茎、萼片和叶柄组织中高表达,其中St CHS4与St CHS5在多数组织均高表达,并参与多种胁迫响应。2.在不同色泽材料中,K149-10、K149-12和K149-15等紫色马铃薯材料的总酚含量、类黄酮含量、花青素含量以及总抗氧化能力显著高于黄色和白色材料,且与紫色色素累积量呈正比。可溶性糖含量在不同色泽材料中无显著差异。在不同生长时期,总酚含量呈降低趋势,类黄酮含量与可溶性糖含量呈先升高后降低趋势,各生理指标在马铃薯第三时期均有所下降。通过生理指标与CHS基因表达量间相关性分析,筛选出与类黄酮及花青素累积呈显著正相关的CHS基因家族成员St CHS4与St CHS5。3.为探究St CHS4与St CHS5基因生物学功能,进行了基因克隆分析。St CHS4与St CHS5基因开放阅读框全长均为1 170 bp,编码389个氨基酸。不同色泽块茎薯肉q RT-PCR分析显示,紫色马铃薯块茎中St CHS4与St CHS5表达水平显著高于白色和黄色,进一步表明St CHS4和St CHS5基因与马铃薯块茎花青素积累显著相关。烟草瞬时表达试验结果显示,过表达St CHS4与St CHS5的烟草叶片前期具有显著花青素累积,而类黄酮无显著差异。通过烟草遗传转化,分别获得3个St CHS4和St CHS5转基因株系,生理指标测定结果表明St CHS4和St CHS5在花青素与类黄酮生物合成中发挥一定作用。

关键词：马铃薯花青素抗氧化能力查尔酮合成酶功能解析

玉米穗发芽突变体viviparous17的图位克隆及功能解析

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玉米穗发芽突变体viviparous17的图位克隆及功能解析

作者：向文文仲恺农业工程学院

学位级别：硕士

休眠是种子植物在长期进化过程中产生的适应性性状,植物通过抑制种子萌发保证其在逆境中生存。在植物种子发育过程中,以ABA/GA平衡为核心的多种激素调控网络共同参与种子休眠与萌发过程。在实际生产中,为了保证种子的高萌发率,大部分作... 详细信息

休眠是种子植物在长期进化过程中产生的适应性性状,植物通过抑制种子萌发保证其在逆境中生存。在植物种子发育过程中,以ABA/GA平衡为核心的多种激素调控网络共同参与种子休眠与萌发过程。在实际生产中,为了保证种子的高萌发率,大部分作物的种子往往呈现出较低的休眠水平。然而过低的休眠水平导致成熟的种子在母体上直接萌发或出现穗发芽现象,致使农业生产中种子的产量和质量下降。因此,研究种子休眠和萌发的调控机制对其农业生产具有重要指导意义。玉米(Zea Mays L.)作为世界上最重要的粮食、饲料、能源和工业原料作物,在保证粮食安全、经济发展及缓解危机方面作用巨大。玉米穗发芽,在上世纪20年代就有报道,到目前为止相继鉴定了约16个穗发芽突变体并已经克隆了9个基因,且大部分基因主要参与ABA生物合成途径,因此需要加快鉴定并挖掘调控玉米种子休眠和萌发的新基因并解析其功能。本研究通过对玉米穗发芽vp17突变体进行表型分析、穗发芽基因遗传分析、候选基因的图位克隆、不同遗传背景的等位性测验和转录组学分析,得到以下结果:1.与野生型相比,突变体vp17在授粉后18天籽粒颜色为白色。随着授粉后天数的增加,在授粉后27天出现了穗发芽的现象,在授粉后28天穗发芽突变体子叶为浅绿色,离体培养后转为白化苗。细胞学观察显示,突变体vp17淀粉层中的淀粉粒形态异常,淀粉层结构松散。2.通过类胡萝卜素含量和激素水平等的测定,野生型籽粒中紫黄质、玉米黄素和叶黄素相对含量较高,但突变体籽粒中基本检测不到,仅叶黄素有部分积累。激素含量测定结果显示,与野生型相比,突变体vp17籽粒中的脱落酸含量显著下降,赤霉素主要活性物质GA含量显著上升,生长素主要活性物质3-吲哚乙酸的含量显著上升,茉莉酸和茉莉酸-异亮酸含量显著下降。3.构建Ye478×B73 F分离群体,进行遗传模型分析,结果显示突变表型受一对隐性基因调控。将vp17基因导入不同遗传背景的自交系中,构建F和F分离群体。发现F中不存穗发芽现象,F中野生型籽粒与穗发芽籽粒的比值均为3:1,说明vp17突变表型能够稳定遗传且不受遗传背景的影响。4.通过BSA等图位克隆方法将候选区间确定在M113和M114两个分子标记之间,物理距离为0.84Kb,只包含1个候选基因,基因ID为Zm00001d019124,命名为VP17。VP17编码9,9’-二顺-ζ-胡萝卜素去饱和酶(9,9’-di-cis-ζ-carotene desaturase),是VP9的新的等位突变,参与全反式-番茄红素生物合成途径Ⅱ,催化zeta-胡萝卜素转化为番茄红素。5.通过对野生型和突变体籽粒的转录组数据分析,结果显示365个显著差异表达基因,与野生型相比,有223个基因表达上调,142基因表达下调。对显著差异表达基因进行GO和KEGG分析,结果表明GO富集中,氧化脂代谢过程(oxylipin metabolic process)、金属离子结合(metal ion binding)和阳离子结合(cation binding)GO亚类上的基因比率均超过20%。通过KEGG富集分析,发现这些差异表达基因主要富集在苯并恶嗪酮生物合成(ko00402)和亚油酸代谢(ko00380)途径中。通过对富集GO和KEGG通路中的基因和调控网络进行分析,发现这些基因均与种子萌发调控相关,因此可以推测vp17基因突变能够引起调控种子萌发相关基因特异性表达。6.与野生型相比,ABA关联的差异表达基因,其中有2个基因表达水平上调,3个基因表达水平下调;与GA关联的9个差异表达基因,8个上调表达,只有1个基因表达水平下降;与其他激素关联的差异表达基因只有EH关联基因下调;在内源生理因素关联的差异表达,所有基因均下调;在ABC载体蛋白类、油质蛋白类、胚胎特化蛋白类、球蛋白类和水孔蛋白类中所有关联基因表达水平均下调。KEGG显著富集的两条通路中差异表达基因在突变体中表达水平均上调。结果表明vp17基因突变可能会导致萌发后相关基因的表达。

关键词：穗发芽种子休眠和萌发图位克隆功能解析转录组学分析

软枣猕猴桃AaMYB16转录因子响应冻胁迫的功能解析

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软枣猕猴桃AaMYB16转录因子响应冻胁迫的功能解析

作者：刘硕东北林业大学

学位级别：硕士

软枣猕猴桃是一种我国北方常见的野生果树,具有较高的经济价值,由于纬度影响,低温胁迫在我国北方频频发生,对植物的生长发育、产量和品质均产生了负面影响。本试验以北方常见的经济植物软枣猕猴桃为研究对象,利用分子生物学、植物生理... 详细信息

软枣猕猴桃是一种我国北方常见的野生果树,具有较高的经济价值,由于纬度影响,低温胁迫在我国北方频频发生,对植物的生长发育、产量和品质均产生了负面影响。本试验以北方常见的经济植物软枣猕猴桃为研究对象,利用分子生物学、植物生理学、生物化学等技术手段,克隆了AaMYB16基因,对AaMYB16蛋白进行亚细胞定位,构建植物表达载体GV1300-AaMYB16,瞬时转化离体软枣猕猴桃叶片和稳定遗传转化拟南芥,挖掘AaMYB16蛋白的互作蛋白,对软枣猕猴桃中响应冻胁迫的R2R3-MYB转录因子的功能进行解析。主要研究结果如下:1、软枣猕猴桃AaMYB16基因全长1200 bp,编码399个氨基酸,属于R2R3-MYB基因家族。系统进化树显示该蛋白与山梨猕猴桃、美味猕猴桃、葡萄中的同源蛋白的进化关系较近。2、构建GV1300-AaMYB16瞬时侵染洋葱表皮和烟草叶片进行亚细胞定位,结果显示AaMYB16:GFP定位于细胞核。冻胁迫下,离体转基因软枣猕猴桃叶片中的ROS积累量高于对照,低温胁迫相关基因Aa CBF、Aa Gol S、Aa KIN1、Aa SAG21、Aa COR47的相对表达量均低于对照;转基因拟南芥的存活率、叶片含水量、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活性、脯氨酸含量、叶绿素含量、花青素含量均低于对照;叶片萎蔫率、离子渗透率、叶片中ROS的积累量、丙二醛（MDA）含量均高于对照。低温胁迫相关基因At CBF1、At CBF2、At CBF3、At KIN1、At COR47的相对表达量均低于对照。结果说明AaMYB16能够响应冻胁迫,并且过量表达AaMYB16基因使离体软枣猕猴桃叶片和拟南芥的抗冻性减弱,具有负调控CBF低温信号传导的功能。3、构建pGBKT7-AaMYB16酵母表达载体、p SPYNE-AaMYB16双分子荧光互补表达载体、p CAMIA1300-n LUC-AaMYB16双荧光素酶表达载体分别进行酵母双杂交试验、双分子荧光互补试验和双荧光素酶试验验证AaMYB16与bHLH蛋白的互作关系,结果显示:AaMYB16蛋白有自激活活性,AaMYB16蛋白与AabHLH18蛋白不存在相互作用关系,AaMYB16蛋白与AabHLH137蛋白存在相互作用关系。

关键词：软枣猕猴桃 AaMYB16基因冻胁迫功能解析

黄瓜抗枯萎病MicroRNA及其靶基因鉴定与功能解析

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黄瓜抗枯萎病MicroRNA及其靶基因鉴定与功能解析

作者：咸倩倩扬州大学

学位级别：硕士

黄瓜（Cucumis sativus L.,2n=2x=14）是世界范围内广泛栽培的蔬菜作物之一。随着我国设施栽培黄瓜面积的不断扩大,土壤连作障碍现象日益突出,其中,黄瓜枯萎病已成为设施黄瓜连作障碍最突出的表现,严重制约了黄瓜的优质高效栽培。因此,... 详细信息

黄瓜（Cucumis sativus L.,2n=2x=14）是世界范围内广泛栽培的蔬菜作物之一。随着我国设施栽培黄瓜面积的不断扩大,土壤连作障碍现象日益突出,其中,黄瓜枯萎病已成为设施黄瓜连作障碍最突出的表现,严重制约了黄瓜的优质高效栽培。因此,挖掘枯萎病抗性基因进而创制黄瓜抗枯萎病品种具有迫切的生产需求。实验室前期对68份黄瓜自交系进行了枯萎病抗性鉴定,发现不同黄瓜自交系苗期对枯萎病的抗性存在显著差异,确定‘日节成’和‘Superina’分别为耐枯萎病与感枯萎病自交系。基于此,本研究以耐枯萎病的‘日节成’为试材,在真叶期接种黄瓜枯萎病菌,于接菌后不同时间点（0,48和96 h）取根系进行miRNA测序分析;进而利用双荧光素酶实验、qRT-PCR、病毒诱导基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）技术、酵母双杂交等技术分析应答枯萎病菌接种的miRNA的靶基因功能。主要研究结果如下:1.miRNA测序分别获得390和755个成熟与发夹miRNA,其中,相对于对照处理,1 1个miRNA在枯萎病接种后显著上调表达;qRT-PCR进一步验证miRNA的表达水平,发现miR6300和miR319a在黄瓜接种枯萎病菌后明显下调表达。在接种枯萎病的‘日节成’中qRT-PCR分析发现,miR6300和miR319a的21个靶基因中,miR319a对应的靶基因 CsJRL3（Jacalin-like lectin domain,Csa2G362470）,miR6300对应的靶基因CsBEE1（Helix-loop-helix DNA-binding domain,Csa1G024150）、CsDAHP1（Class-Ⅱ DAHP synthetase,Csa2G369040）和 CsPERK2（SPOC domain,Csa4G642480）显著上调表达;进一步通过双荧光素酶实验分析了miR6300和miR319a与其对应靶基因的互作关系,初步明确CsBEE1、CsJRL3、CsDAHP1、CsPERK2为黄瓜抗枯萎病的候选基因。2.利用黄瓜绿斑驳病毒（CGMMV）介导的VIGS技术在黄瓜中分别沉默黄瓜抗枯萎病候选基因CsBEE1、CsJRL3、CsDAHP1和CsPERK2,通过枯萎病菌接种后的表型鉴定、发病率比较分析及组织染色发现,沉默CsBEE1显著降低枯萎病的抗性。‘日节成’受水杨酸诱导后CsBEE1表达量显著上调,沉默CsBEE1后内源水杨酸含量显著下调,可见CsBEE1参与水杨酸的合成。通过酵母双杂交技术筛选到1 1个CsBEE1的互作蛋白,进一步结合枯萎病菌接种‘日节成’并进行转录组测序,筛选出3个差异表达基因:CsNRRL1（Haem peroxidase,Csa4G285760）、CsCAB1（Chlorophyll A-B binding protein,Csa6G139 750）和 CsCHS2（Concanavalin A-like lectin,Csa7G044980）,对其进行qRT-PCR验证发现,CsNRRL1和CsCAB1差异显著,推测CsBEE1可能通过调控CsNRRL1和CsCAB1的表达进而参与对枯萎病的防御反应。本研究为今后筛选黄瓜抗枯萎病基因、黄瓜抗枯萎病分子遗传改良和种质创新利用奠定了初步的理论基础。

关键词：黄瓜黄瓜枯萎病 microRNA 抗病基因功能解析

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苹果和梨抗旱基因挖掘与功能解析

苹果和梨抗旱基因挖掘与功能解析

作者：张旭瑶河北工程大学

学位级别：硕士

苹果和梨是国内北方地区产量与种植区域最大的水果之一,而干旱胁迫又是限制北方果树栽植的重要阻碍。本研究以苹果为试材,利用qRT-PCR技术筛选出受干旱胁迫强烈诱导上调表达的基因MdZHD1,通过叶片对该基因进行功能解析;此外,本研究利用... 详细信息

苹果和梨是国内北方地区产量与种植区域最大的水果之一,而干旱胁迫又是限制北方果树栽植的重要阻碍。本研究以苹果为试材,利用qRT-PCR技术筛选出受干旱胁迫强烈诱导上调表达的基因MdZHD1,通过叶片对该基因进行功能解析;此外,本研究利用梨基因组数据库对PbrLhc基因家族开展了染色体定位、基因理化性质、基因结构、信号肽预测、共线性分析等多个方面的生物信息学分析。得出的主要结果如下:(1)本论文研究了苹果在干旱胁迫不同时间节点上生理指标的变化。经研究发现,随着干旱胁迫处理时间的增加,过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)的含量均呈现出先升高后降低的趋势,其中CAT和过氧化物酶(POD)的含量分别在T1(6 h)和T2(12 h)阶段时达到最高;过氧化物酶(POD)、脯氨酸(PRO)的含量呈现逐步升高的趋势,在T4阶段(48 h)时达到峰值;超氧化物歧化酶(SOD)活性表现出先急剧升高后逐步平缓的趋势,在T3阶段(24 h)后达到最高,T4阶段(48 h)时达到最低。(2)本研究以苹果为试材,利用qRT-PCR技术筛选出受干旱胁迫强烈诱导上调表达的基因MdZHD1。利用基因登录号(HF07511)于苹果基因组中获取基因序列,对苹果MdZHD1基因进行克隆。该基因编码区序列全长969 bp,可编码322个氨基酸,等电点为9.17。系统进化树分析表明,苹果MdZHD1与拟南芥AtZHD11、AtZHD12以及苹果MdZHD14的亲缘关系较近;氨基酸序列比对结果显示,苹果MdZHD1与MdZHD9、MdZHD12、MdZHD14等ZHD蛋白同源相似度较高,其中与MdZHD14同源相似度最高。亚细胞定位分析表明,MdZHD1蛋白作为转录因子定位于细胞核。此外,利用Plantcare软件预测了MDZHD1基因编码区的上游启动子元件,结果显示启动子元件中含有多个与非生物胁迫和胁迫激素等有关的功能作用元件。通过qRT-PCR技术对不同时间处理的非生物胁迫进行表达分析,表明该基因的表达水平会受到低温、干旱、高盐胁迫诱导上调表达。苹果MdZHD转基因愈伤通过减少相对电导率和丙二醛(MDA)水平,从而增强苹果愈伤对干旱胁迫的抗旱性,也表明该基因可能正向调控苹果的干旱胁迫反应。(3)本研究共鉴定出PbrLhc家族基因28个,PbrLhc基因在25条染色体上均有分布,且分布较为均匀。绝大多数染色体上仅分布有一个基因;而仅有一条染色体上同时分布有3个基因。部分基因的理化特性预测结果表明,此类基因可编码247-271个氨基酸,预测的蛋白分子量介于26.72 k Da-29.11 k Da,蛋白质等电点范围从5.85-7.9。PbrLhc蛋白的系统发育关系分析显示,PbrLhc蛋白可分为5个亚科(CP24,CP26,CP29,Lhca,和Lhcb),且PbrLhc基因在不同亚组中的分布呈现不均衡性。梨Lhc基因内含子/外显子的分布结果显示,不同的PbrLhc基因,外显子/内含子结构存在很大差异。其中,8个基因仅有一个外显子;7个基因的结构中有2个外显子;而外显子PbrLhca5的外显子数量最多,高达6个。绝大多数的PbrLhc成员均含有基序1、2、3、9、10。不同的成员,含有的保守基序差异较大,但在同一亚族中的成员均具有相似的保守基序。PbrLhcs基因编码区上游启动子序列中存在大量的bZIP,MYB、TCP、bHLH、NAC等转录因子结合位点。所有被鉴定的PbrLhcs蛋白均预测定位于膜结合叶绿体,且均无信号肽可剪切位点的存在。基因表达热图显示5个基因在灌水后下调表达,而在干旱处理后被诱导而上调表达;7个基因在灌水处理后表达上调,干旱处理后下调表达。PbrLhcb1.7基因在灌水和干旱处理不同时间后均无明显变化;其余的基因在两种处理不同时间节点后,其表达水平规律不一。其中共线性分析表明,不同PbrLhc基因之间存在着共线性关系;此外,同种同源关系中,梨属与拟南芥的亲缘关系也有某些共线性。

关键词：果树 MdZHD1基因干旱胁迫功能解析生物信息学 Lhc转录因子

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水稻特异羟基肉桂酰酪胺基因簇的功能解析

中国科学：生命科学 2021年第5期51卷 594-596页

作者：王国栋中国科学院遗传与发育生物学研究所种子创新研究院植物基因组学国家重点实验室北京100101

生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster,BGC)由多个(至少三个)行使不同催化功能酶的编码基因在染色体上相邻或是相近的位置组成.典型的生物合成基因簇负责生成一个或几个结构类似的生物活性特异性代谢物(specialized metabolite)[1]... 详细信息

生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster,BGC)由多个(至少三个)行使不同催化功能酶的编码基因在染色体上相邻或是相近的位置组成.典型的生物合成基因簇负责生成一个或几个结构类似的生物活性特异性代谢物(specialized metabolite)[1].与原核生物基因组中常见的操纵子不同,植物基因组中的生物合成基因簇被认为是一种比较罕见的现象.

关键词：催化功能生物合成基因簇功能解析操纵子植物基因组

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蓖麻RcPIPs基因功能解析

蓖麻RcPIPs基因功能解析

作者：孟迪内蒙古民族大学

学位级别：硕士

土壤盐渍化是限制农业发展的重要因素之一。基因工程手段选育耐盐作物品种,是改良和利用盐碱地的有效手段之一。本研究基于“哲蓖3号”种子萌发期的转录组数据,筛选出上调表达的水通道蛋白家族的RcPIP2-4和RcPIP2-6基因,通过基因克隆、... 详细信息

土壤盐渍化是限制农业发展的重要因素之一。基因工程手段选育耐盐作物品种,是改良和利用盐碱地的有效手段之一。本研究基于“哲蓖3号”种子萌发期的转录组数据,筛选出上调表达的水通道蛋白家族的RcPIP2-4和RcPIP2-6基因,通过基因克隆、荧光定量分析、生物信息学分析、构建植物过表达和CRISPR/Cas9编辑载体、农杆菌介导法转化蓖麻并测定各类生理指标,分析该基因调控植株耐盐的生理生化和分子机理,对RcPIPs基因进行功能解析。该研究为植物抗逆基因工程和获得蓖麻抗盐新种质奠定基础。主要研究结果如下:以“哲蓖3号”为试验材料,克隆获得了RcPIP2-4和RcPIP2-6基因。RcPIP2-4的开放阅读框(Open Reading Frames,ORF)为864 bp,编码287个氨基酸残基,二级无规卷曲结构最多,达122个。三级结构为常见结构,含有6个跨膜结构,为MIP超家族成员;RcPIP2-6的ORF为858 bp,编码285个氨基酸残基,二级α-螺旋结构最多,达117个。三级结构为常见结构,含有6个跨膜结构,为MIP超家族成员。利用q RT-PCR测定盐胁迫下不同时长蓖麻苗期根茎叶中两基因表达量,发现RcPIP2-4和RcPIP2-6基因在蓖麻根、茎、叶中均有表达;两个基因均在蓖麻茎中表达量最高,根和叶中次之。经过根癌农杆菌介导,运用组织培养、提取DNA、PCR检测目的基因的技术手段,分别鉴定出含有RcPIP2-4、RcPIP2-6和CRISPR/Cas9-RcPIP2-6基因阳性植株11株、6株、5株。生理指标测定结果显示,过表达RcPIP2-4、RcPIP2-6基因在盐胁迫下的蓖麻叶片中Na普遍比野生型低,K普遍比野生型高;电导率(Relative conductive,REL)、丙二醛(Malon dialdehyde,MDA)含量趋势类似,转基因植株均低于野生型植株;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性类似,转基因植株均高于野生型植株,表现出了更强的盐耐受性。CRISPR/Cas9编辑RcPIP2-6基因,发现在盐胁迫下的蓖麻叶片中的离子情况与过表达RcPIP2-4、RcPIP2-6基因相反;REL、MDA含量趋势相似,转基因植株均高于野生型植株;SOD、CAT活性相似,转基因植株均低于野生型植株。

关键词：蓖麻盐胁迫 RcPIP2-4 RcPIP2-6 功能解析