苹果和梨抗旱基因挖掘与功能解析

作     者：张旭瑶 

作者单位：河北工程大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴瑞刚;申飞

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：果树 MdZHD1基因 干旱胁迫 功能解析 生物信息学 Lhc转录因子 

摘      要：苹果和梨是国内北方地区产量与种植区域最大的水果之一,而干旱胁迫又是限制北方果树栽植的重要阻碍。本研究以苹果为试材,利用qRT-PCR技术筛选出受干旱胁迫强烈诱导上调表达的基因MdZHD1,通过叶片对该基因进行功能解析;此外,本研究利用梨基因组数据库对PbrLhc基因家族开展了染色体定位、基因理化性质、基因结构、信号肽预测、共线性分析等多个方面的生物信息学分析。得出的主要结果如下:(1)本论文研究了苹果在干旱胁迫不同时间节点上生理指标的变化。经研究发现,随着干旱胁迫处理时间的增加,过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)的含量均呈现出先升高后降低的趋势,其中CAT和过氧化物酶(POD)的含量分别在T1(6 h)和T2(12 h)阶段时达到最高;过氧化物酶(POD)、脯氨酸(PRO)的含量呈现逐步升高的趋势,在T4阶段(48 h)时达到峰值;超氧化物歧化酶(SOD)活性表现出先急剧升高后逐步平缓的趋势,在T3阶段(24 h)后达到最高,T4阶段(48 h)时达到最低。(2)本研究以苹果为试材,利用qRT-PCR技术筛选出受干旱胁迫强烈诱导上调表达的基因MdZHD1。利用基因登录号(HF07511)于苹果基因组中获取基因序列,对苹果MdZHD1基因进行克隆。该基因编码区序列全长969 bp,可编码322个氨基酸,等电点为9.17。系统进化树分析表明,苹果MdZHD1与拟南芥AtZHD11、AtZHD12以及苹果MdZHD14的亲缘关系较近;氨基酸序列比对结果显示,苹果MdZHD1与MdZHD9、MdZHD12、MdZHD14等ZHD蛋白同源相似度较高,其中与MdZHD14同源相似度最高。亚细胞定位分析表明,MdZHD1蛋白作为转录因子定位于细胞核。此外,利用Plantcare软件预测了MDZHD1基因编码区的上游启动子元件,结果显示启动子元件中含有多个与非生物胁迫和胁迫激素等有关的功能作用元件。通过qRT-PCR技术对不同时间处理的非生物胁迫进行表达分析,表明该基因的表达水平会受到低温、干旱、高盐胁迫诱导上调表达。苹果MdZHD转基因愈伤通过减少相对电导率和丙二醛(MDA)水平,从而增强苹果愈伤对干旱胁迫的抗旱性,也表明该基因可能正向调控苹果的干旱胁迫反应。(3)本研究共鉴定出PbrLhc家族基因28个,PbrLhc基因在25条染色体上均有分布,且分布较为均匀。绝大多数染色体上仅分布有一个基因;而仅有一条染色体上同时分布有3个基因。部分基因的理化特性预测结果表明,此类基因可编码247-271个氨基酸,预测的蛋白分子量介于26.72 k Da-29.11 k Da,蛋白质等电点范围从5.85-7.9。PbrLhc蛋白的系统发育关系分析显示,PbrLhc蛋白可分为5个亚科(CP24,CP26,CP29,Lhca,和Lhcb),且PbrLhc基因在不同亚组中的分布呈现不均衡性。梨Lhc基因内含子/外显子的分布结果显示,不同的PbrLhc基因,外显子/内含子结构存在很大差异。其中,8个基因仅有一个外显子;7个基因的结构中有2个外显子;而外显子PbrLhca5的外显子数量最多,高达6个。绝大多数的PbrLhc成员均含有基序1、2、3、9、10。不同的成员,含有的保守基序差异较大,但在同一亚族中的成员均具有相似的保守基序。PbrLhcs基因编码区上游启动子序列中存在大量的bZIP,MYB、TCP、bHLH、NAC等转录因子结合位点。所有被鉴定的PbrLhcs蛋白均预测定位于膜结合叶绿体,且均无信号肽可剪切位点的存在。基因表达热图显示5个基因在灌水后下调表达,而在干旱处理后被诱导而上调表达;7个基因在灌水处理后表达上调,干旱处理后下调表达。PbrLhcb1.7基因在灌水和干旱处理不同时间后均无明显变化;其余的基因在两种处理不同时间节点后,其表达水平规律不一。其中共线性分析表明,不同PbrLhc基因之间存在着共线性关系;此外,同种同源关系中,梨属与拟南芥的亲缘关系也有某些共线性。