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黄鳝内脏碱性磷酸酶功能基团的初步研究

西南农业大学学报（自然科学版） 2005年第6期27卷 906-908,926页

作者：黄毅唐云明彭萍西南大学生命科学学院重庆400715

经Tris-HC l缓冲液(pH 8.6)抽提,正丁醇脱脂,硫酸铵分级沉淀分离,DEAE-Sepharose Fast F low和Sephacryl S-200柱层析,从黄鳝内脏中提取出电泳纯的碱性磷酸酶。用PCMB,NBS,PMSF,TNBS,SUAN,DTT及IAA在一定条件下选择性修饰该酶的各种氨... 详细信息

经Tris-HC l缓冲液(pH 8.6)抽提,正丁醇脱脂,硫酸铵分级沉淀分离,DEAE-Sepharose Fast F low和Sephacryl S-200柱层析,从黄鳝内脏中提取出电泳纯的碱性磷酸酶。用PCMB,NBS,PMSF,TNBS,SUAN,DTT及IAA在一定条件下选择性修饰该酶的各种氨基酸残基,并对酶活力的变化作出测定。结果表明,PMSF,NBS,TNBS,SUAN和DTT的修饰能显著抑制酶的活性,且酶活力降低程度与修饰剂的浓度相关;IAA和PCMB的修饰不表现对酶的抑制作用。初步认为,Ser,Lys和Trp残基为黄鳝碱性磷酸酶的必需功能基团,部分二硫键对保护酶的催化能力是必需的。

关键词：黄鳝碱性磷酸酶功能基团

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甘薯叶多酚氧化酶的分离纯化及部分性质与功能基团研究

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甘薯叶多酚氧化酶的分离纯化及部分性质与功能基团研究

作者：梁建荣西南大学

学位级别：硕士

多酚氧化酶(polyphenol oxidase, EC1.***.3.1,简称PPO)是一类广泛存在于植物、动物、微生物等体内的一类铜结合酶。多酚氧化酶在植物体内能够催化酚类物质生成邻醌,醌类再进一步氧化生成褐色素。多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要原因之一... 详细信息

多酚氧化酶(polyphenol oxidase, EC1.***.3.1,简称PPO)是一类广泛存在于植物、动物、微生物等体内的一类铜结合酶。多酚氧化酶在植物体内能够催化酚类物质生成邻醌,醌类再进一步氧化生成褐色素。多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要原因之一,会降低果蔬等的营养价值及经济价值,并影响其风味及品质。此外,多酚氧化酶与植物抗病、植物光合作用、花色形成、乙烯生成等方面都有联系。甘薯叶作为一种耐寒耐贫瘠的绿色蔬菜,含有丰富的矿物质、维生素等,可提高人体抗病能力,有降血糖,抗肿瘤等作用,已引起大家广泛关注。目前,对甘薯叶多酚氧化酶的分离纯化未见报道。本文以甘薯叶为材料,对多酚氧化酶的分离纯化、酶学性质、抑制剂及功能基团的化学修饰等方面进行了研究,以将甘薯叶的利用价值得到开发,提高其经济效益。主要研究结果如下：本文通过对新鲜甘薯叶进行组织匀浆、磷酸盐缓冲液抽提得到粗酶,再经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析等纯化步骤,最终从甘薯叶中得到了多酚氧化酶的电泳纯制品。纯化得到的酶比活力为50075.43U/mg,纯化倍数为597.99,回收率为0.48%。理化性质研究表明,甘薯叶多酚氧化酶的全酶的相对分子质量128.6kd,亚基相对分子质量约为64.4kd,可见该酶由两个相同的亚基组成。该酶的最适温度为35℃,在25-55℃内酶有较好的稳定性。最适pH为6.5,在pH6-7内酶较稳定。在最适条件下,以不同浓度的邻苯二酚溶液为底物测得该酶的Km值为0.0445mol/L。金属离子Ca2+、Hg2+对甘薯叶多酚氧化酶有明显的抑制作用;Pb2+、C02+、Fe2+对甘薯叶多酚氧化酶有明显的激活作用;K+、Mn2+、Li+、Zn2+、Mg2+、Ba2+对该酶活性基本无影响。研究有机溶剂对甘薯叶多酚氧化酶的抑制作用,甲醇、乙醇和异丙醇对甘薯叶多酚氧化酶活性抑制强度不同,异丙醇抑制作用最强,乙醇次之,甲醇抑制作用相对最弱。低浓度的抗坏血酸和亚硫酸钠对该酶有强烈的抑制作用,柠檬酸次之,EDTA-2Na的抑制效果相对较弱,尿素对该酶基本无影响。用化学修饰剂对该酶的功能基团进行修饰,发现二巯基苏糖醇(DTT)和乙酰丙酮(BD)能显著地抑制该酶活性,氯胺-T、NAI对酶有一定的激活作用,BrAc、顺丁烯二酸酐、SUAN、PCMB、PMSF对酶活性影响不大。因此认为甘薯叶多酚氧化酶的必需基团可能包括精氨酸残基和二硫键。

关键词：甘薯叶多酚氧化酶分离纯化性质功能基团

牛肝谷氨酸脱氢酶的分离纯化及酶学性质和功能基团研究

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牛肝谷氨酸脱氢酶的分离纯化及酶学性质和功能基团研究

作者：王丹西南大学

学位级别：硕士

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)是一种广泛存在于生物体的细胞线粒体基质中,连接糖类代谢和氨基酸代谢的关键酶,对细胞内许多代谢过程具有重要的作用,如柠檬酸循环,氮代谢等,主要催化α-酮戊二酸和谷氨酸之间的可逆转化,从... 详细信息

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)是一种广泛存在于生物体的细胞线粒体基质中,连接糖类代谢和氨基酸代谢的关键酶,对细胞内许多代谢过程具有重要的作用,如柠檬酸循环,氮代谢等,主要催化α-酮戊二酸和谷氨酸之间的可逆转化,从而参与谷氨酸的合成与分解;根据GDH在催化反应时所依赖的辅酶类型的不同,可将其分为3类:NAD依赖型(NAD-GDH)、NADP依赖型(NADP-GDH)和NAD(P)依赖型(NAD(P)-GDH);在生物体内,GDH以四聚体或六聚体的形式存在。GDH在医学药物分析、生物化学分析等领域具有重要的应用价值。迄今为止,已有多种材料来源的GDH得到了深入的研究,但国内还未见有从牛肝中提纯GDH的方法及理化性质研究的相关报道,且所需GDH主要依赖于国外生产。本研究选取来源广、成本低的牛肝脏为实验材料,从中分离纯化出GDH并对其理化性质进行研究,同时利用来源于NCBI上的数据对GDH进行了生物信息学分析,结果如下:1.牛GDH生物信息学分析牛GLUD1的cDNA全长2446 bp,包含13个外显子和12个内含子,ORF全长1686 bp,编码561个氨基酸;氨基酸序列主要含两个保守结构域,ELFVehydrog结构域和NADindluH结构域;与其他几种哺乳动物的GLUD1氨基酸序列全长相似性达93%-99%,与家鸡的相似性为71%,与非洲爪蟾蜍的相似性为85%;在进化关系中,牛与绵羊聚为一支,亲缘关系最接近。2.牛肝GDH的分离纯化新鲜牛肝,经去血后匀浆、Tris-HCL缓冲液抽提、正丁醇脱脂、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析后获得了电泳纯的牛肝GDH。结果显示GDH的酶活回收率为23.12%,比活力为306.06 U/mg,纯化倍数为93.60倍。3.牛肝GDH的酶学性质研究GDH的全酶分子量约380.20 kD,亚基分子质量约61.7 kD,由此推测该酶由六个相同亚基构成。酶学性质研究结果表明:GDH的最适反应温度为50℃,在20℃0℃范围内较稳定;最适反应pH值为8.2,在pH 50范围内较稳定,具有较强的酸碱耐受性;该酶对NADH的Km值为0.696 mmol/L。4.不同金属离子、化合物和有机溶剂对GDH的影响Ba2+、Li+、K+、Mg2+对GDH活性的影响具有两重性,即低浓度激活,较高浓度时抑制,低浓度的Zn2+、Cu2+、Pb2+、Ag+对该酶表现为强烈的抑制作用,Co2+、Ca2+、Cd2+随着浓度的增加抑制作用加强;草酸、尿素、抗坏血酸、SDS对该酶均表现为抑制作用,EDTA对该酶具有一定的激活作用;甲醇、乙醇和异丙醇对该酶具有较强的抑制作用。5.牛肝GDH功能基团的研究通过不同的化学修饰剂对该酶功能基团进行修饰,结果表明:甲硫氨酸的硫醚基,半胱氨酸的巯基以及赖氨酸残基构成牛肝谷氨酸脱氢酶活性中心的必需基团,丝氨酸残基,色氨酸残基,二硫键,精氨酸残基,组氨酸残基及酪氨酸酚羟基与牛肝谷氨酸脱氢酶活性中心的构成没有直接关系,不是该酶活性中心所必需的基团。

关键词：牛肝生物信息学谷氨酸脱氢酶分离纯化酶学性质功能基团

猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及性质和功能基团研究

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猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及性质和功能基团研究

作者：傅婷西南大学

学位级别：硕士

乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH,EC1.***.1.27)广泛存在于人和哺乳动物的肝脏、植物组织及微生物中,是生物体内重要的氧化还原催化剂之一。在许多有机体中,伴随着氧化型的辅酶I(NAD+)被还原成还原型辅酶Ⅰ(NADH)它可以可逆地将短... 详细信息

乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH,EC1.***.1.27)广泛存在于人和哺乳动物的肝脏、植物组织及微生物中,是生物体内重要的氧化还原催化剂之一。在许多有机体中,伴随着氧化型的辅酶I(NAD+)被还原成还原型辅酶Ⅰ(NADH)它可以可逆地将短链醇、芳香醇等催化氧化为其相应的羧基化合物。该酶应用广泛,目前已被应用于临床、化工及食品等领域,现在国内市场上的ADH产品几乎都源自于酒酿酵母,因其来源单一、高纯度ADH基本需要依靠进口,不能满足各领域的需求。所以开发不同来源、高纯度、低成本的ADH在理论和实践方面均具有十分重要的意义。猪作为一种常见的畜养农业动物,其遗传和生理特性与人类十分相似,正因如此,它被公认为是最有用且最全能的实验模式动物之一,对农业和人类疾病的研究具有十分重要的意义。本文通过对猪肝乙醇脱氢酶进行分离纯化及部分性质和功能基团的研究,旨在为ADH的获得提供一条新途径,为人类医学研究和以后的深入研究提供数据参考。研究结果如下:1.猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化新鲜猪肝经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得了电泳纯的乙醇脱氢酶。纯化的结果显示:该酶比活力为1 622.33 U/mg,回收率为29.05%,纯化倍数为34.58。2.猪肝乙醇脱氢酶的性质研究猪肝乙醇脱氢酶的全酶分子质量约171.79 kD,亚基分子质量约43.68 kD,因此可推测该酶由4个相同亚基构成;最适反应温度和pH分别为45℃和10.0;在255℃及pH 7.5.0范围内稳定性较好;在最适条件下测得该酶对乙醇的Km值为19 mmol/L。氯仿、正丁醇、异丙醇、草酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、Cu2+、Zn2+、Ag+对该酶的抑制作用最强,Mg2+对该酶有一定程度的激活作用;EDTA对该酶表现为双重作用,当浓度小于5 mmol/L时酶活有一定上升,当浓度高于5 mmol/L时,该酶酶活有一定下降趋势。3.猪肝乙醇脱氢酶功能基团的研究用特异性化学修饰剂对猪肝乙醇脱氢酶侧链基团进行选择性修饰结果表明:丝氨酸残基、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基、甲硫氨酸的硫醚基为猪肝乙醇脱氢酶活性中心的必需基团,参与了该酶活性中心的构建;组氨酸的咪唑基可能是该酶活性中心的功能基团;而精氨酸胍基、赖氨酸ε-氨基、酪氨酸酚羟基与猪肝乙醇脱氢酶活性中心无直接关系,故不是猪肝乙醇脱氢酶活性中心的必需基团。

关键词：猪肝乙醇脱氢酶分离纯化性质功能基团

自组装单分子膜的末端功能基团对化学气相沉积铜薄膜的影响

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自组装单分子膜的末端功能基团对化学气相沉积铜薄膜的影响

作者：刘铮铮浙江大学

学位级别：硕士

铜具有很好的导电性和抗电迁移能力，是一种理想的多级金属化形成的超大规模集成电路(ULSI)中的导线材料。在100nm以下铜金属互连技术中，需要使用厚度＜5nm的扩散阻挡层来阻止铜扩散进入相邻的电介质，并且增强铜在基材表面的附着能力... 详细信息

铜具有很好的导电性和抗电迁移能力，是一种理想的多级金属化形成的超大规模集成电路(ULSI)中的导线材料。在100nm以下铜金属互连技术中，需要使用厚度＜5nm的扩散阻挡层来阻止铜扩散进入相邻的电介质，并且增强铜在基材表面的附着能力。目前，特别是在高深宽比的条件下，传统的阻挡层材料如钽，氮化钽，氮化钛等无法形成厚度小于10nm的均一的连续的薄膜。自组装单分子膜(SAMs)可以通过改变其链长和末端功能基团来形成超薄的具有特定性质的薄膜，因此被广泛的应用于分子器件，平版印刷术和微型仪器等领域中。通过选择合适的末端功能基团，SAMs可以利用末端功能基团与铜之间的相互作用来阻挡铜的扩散和增加铜在基材表面的附着能力，是一种理想的扩散阻挡层材料。本论文在自行设计、组建的金属有机化学气相沉积(MOCVD)系统上，以六氟乙酰丙酮合铜(Ⅱ)[Cu(Ⅱ))(hfac)]为前驱物，氢气为载气和还原性反应气，分别在2-(吡啶)-2-乙基-三甲基硅烷(TMSEP)和丙基三甲氧基硅烷(PTMS)自组装单分子膜(SAMs)改性基材上进行化学气相沉积铜薄膜，并对得到的铜薄膜的性质进行了分析和比较，研究自组装单分子膜的末端功能基团对化学气相沉积铜薄膜的影响。论文主要由以下三个部分组成：一、在PTMS自组装单分子膜改性基材上进行化学气相沉积铜薄膜的相关研究。研究表明：铜与甲基功能团之间的相互作用为van der Waals相互作用，属于弱相互作用，因此甲基对沉积在基材表面的铜没有固定作用，这样就导致铜在PTMS-SAMs改性的表面有团聚现象。PTMS-SAMs的引入对阻止铜扩散进入基材表面具有一定的效果，这主要是烷基链之间的紧密堆积产生的真空层的作用。二、在TMSEP自组装单分子膜改性基材上进行化学气相沉积铜薄膜的相关研究。研究表明：铜与2-吡啶的之间的相互作用主要为铜和芳环之间的配位作用，因此对阻挡铜的扩散和增强表面附着力有一定的效果。整个沉积过程可分为表面反应控制区和传质控制区，两温度区域之间的转换温度为350℃。铜薄膜的接合模式为“填充式(filling in)”，这样有利于形成均匀的铜薄膜。三、研究和比较了铜在拥有不同末端功能基团的SAMs上的化学气相沉积。发现：SAMs的引入不仅能够增加铜在基材表面的附着能力，而且能有效地阻止铜扩散进入基材表面。这是因为SAMs的末端功能基团与铜之间存在着相互作用，起到了固定铜原子的效果。SAMs表面功能基团与铜之间相互作用力的强弱不同，这种固定作用也不相同。末端功能团中反应位点的位置也会影响到Cu在SAMs表面的沉积。当反应位点裸露在SAMs表面时，Cu更容易接触到反应位点，从而发生反应。而当反应位点被周边原子所覆盖时，Cu不容易接触到功能基团上的反应位点，从而影响反应的顺利进行。

关键词：化学气相沉积铜薄膜扩散阻挡层自组装单分子层功能基团相互作用

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缢蛏碱性磷酸酯酶功能基团的化学修饰

厦门大学学报(自然科学版) 1986年第5期 562-567页

作者：余卫平颜思旭厦门大学生物学系

用PMSF、TNBS、NBS、DTNB及溴代乙酸在一定条件下分别选择性地作用于缢蛏两种碱性磷酸酯酸(AKPⅠ和AKPⅡ)的Ser、Lys、Trp、His及巯基,并对酶活力的变化和吸收光谱的变化作了相应的测定。结果表明,PMSF、TNBS和NBS的修饰能显著抑制AKPⅠ... 详细信息

用PMSF、TNBS、NBS、DTNB及溴代乙酸在一定条件下分别选择性地作用于缢蛏两种碱性磷酸酯酸(AKPⅠ和AKPⅡ)的Ser、Lys、Trp、His及巯基,并对酶活力的变化和吸收光谱的变化作了相应的测定。结果表明,PMSF、TNBS和NBS的修饰能显著抑制AKPⅠ和AKPⅡ的活力,活力的降低与修饰剂的浓度有关;溴代乙酸和DTNB对AKPⅠ和AKPⅡ的活力不表现抑制作用。我们初步认为,Ser、Lys和Trp残基可能是AKPⅠ和AKPⅡ的活力必需基团。AKPⅠ的TNBS失活动力学研究还表明一个Lys践基是AKPⅠ表现催化活力所必需的。

关键词： TNBS AKP 活性部位 DTNB 功能基团残基化学修饰缢蛏蛏子

聚天冬氨酸衍生物的不同功能基团对阻垢性能的影响

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清洗世界 2018年第3期34卷 21-26页

作者：吴变喜高玉华河北东源羊绒制品股份有限公司河北石家庄050000 河北省科学院能源研究所河北石家庄050081 河北省工业节水工程技术研究中心河北石家庄050081

利用天冬氨酸、2-氨基乙醇、2-氨基乙磺酸和氢氧化钠等分别合成了含羧酸基聚天冬氨酸衍生物、含磺酸基聚天冬氨酸衍生物和含羟基聚天冬氨酸衍生物。通过静态阻垢实验法和动态阻垢实验法,研究了聚天冬氨酸衍生物的3种不同功能基团对阻垢... 详细信息

利用天冬氨酸、2-氨基乙醇、2-氨基乙磺酸和氢氧化钠等分别合成了含羧酸基聚天冬氨酸衍生物、含磺酸基聚天冬氨酸衍生物和含羟基聚天冬氨酸衍生物。通过静态阻垢实验法和动态阻垢实验法,研究了聚天冬氨酸衍生物的3种不同功能基团对阻垢性能的影响。从实验结果可以看出,在聚天冬氨酸分子结构中引入羧基可以提高其阻垢率,而磺酸基和羟基的引入则会降低其阻垢率;含羧酸基聚天冬氨酸衍生物的动态污垢热阻最小,其动态阻垢率为96.13%。

关键词：聚天冬氨酸衍生物功能基团阻垢性能聚天冬氨酸阻垢剂

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文昌鱼碱性磷酸酶功能基团的修饰与酶活力变化关系

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厦门大学学报(自然科学版) 1980年第4期 85-91页

作者：颜思旭陈素丽陈璇璇蔡红玉林岳夫澳门大学生物学系国家海洋局第三海洋研究所进修生

用DEAE-Cellulose（DE-11）改进了酶的分离提纯方法,将酶提纯163倍,初步获得电泳均一的酶制剂。酶经光氧化后,活力迅速丧失,其失活过程按一级反应进行。酶经N-溴代琥珀酰亚胺作用后活力逐渐丧失。溴代乙酸在较高浓度下亦能抑制酶活力。... 详细信息

用DEAE-Cellulose（DE-11）改进了酶的分离提纯方法,将酶提纯163倍,初步获得电泳均一的酶制剂。酶经光氧化后,活力迅速丧失,其失活过程按一级反应进行。酶经N-溴代琥珀酰亚胺作用后活力逐渐丧失。溴代乙酸在较高浓度下亦能抑制酶活力。酶经酰化后活力亦受抑制。实验结果初步表明:咪唑基吲哚基及氨基都是酶活力所必需的基因。

关键词：酶活力功能基团酶活性文昌鱼双尖鱼头索动物光氧化光化学反应碱性磷酸酶

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几种功能基团在聚氨酯复鞣剂中的作用

西部皮革 1998年第5期 27-28+31页

作者：金勇魏德卿中科院成都有机化学所

本文介绍了羧基、叔胺基、氧化乙烯基、羟甲基这几种常见的功能基团在聚氯酯复鞣剂中所起的作用及引入的方法。

关键词：复鞣剂甲基乙烯基胺基氧化乙烯链烷基链烯烃基环氧乙烷功能基团阳离子基团氢化合物填充能力聚氨酷合成材料丙烯酸树脂吸脂助染