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副猪嗜血杆菌病原夹心ELISA检测方法的建立及应用

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华北农学报 2016年第S1期31卷 463-469页

作者：宋帅李春玲臧莹安郭海祥李淼杨冬霞徐志宏广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室广东省兽医公共卫生实验室粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心广东广州510640 仲恺农业工程学院动物科学系广东广州510225

为了建立一种准确、快速的副猪嗜血杆菌病原夹心ELISA检测方法,以副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的特异性单克隆抗体1E2作为捕获抗体,兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体作为检测抗体,通过方阵滴定优化夹心ELISA检测方法最佳反应条件,并对该检测方法... 详细信息

为了建立一种准确、快速的副猪嗜血杆菌病原夹心ELISA检测方法,以副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的特异性单克隆抗体1E2作为捕获抗体,兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体作为检测抗体,通过方阵滴定优化夹心ELISA检测方法最佳反应条件,并对该检测方法进行特异性、敏感性验证以及临床样品的检测应用。结果显示,该检测方法中单克隆抗体1E2最佳包被浓度为3.434μg/m L,兔抗副猪嗜血杆菌多抗的最佳稀释浓度为3.350μg/m L,用10 mg/m L明胶37℃封闭1 h优于其他封闭液,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多体最佳使用浓度为1∶4 000。该检测方法的特异性试验结果显示可检测出15个血清型的副猪嗜血杆菌病原,而与其他病原菌的检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示该方法能够检测出副猪嗜血杆菌的最低菌落浓度为1×106cfu/m L。利用该检测方法对临床115份副猪嗜血杆菌可疑病料进行检测结果显示可检出83份阳性样品,检出的阳性样品数高于细菌分离及PCR鉴定方法。上述结果表明所建立的副猪嗜血杆菌病原夹心ELISA检测方法特异性强、敏感性好并可应用到临床样品的检测。

关键词：副猪嗜血杆菌单克隆抗体夹心ELISA

副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白的表达及其免疫原性分析

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畜牧兽医学报 2014年第4期45卷 621-630页

作者：张飞都启晶张洋溢文心田黄小波曹三杰四川农业大学预防兽医研究所猪病研究中心雅安625014 四川农业大学动物医学院人兽共患病研究室成都611130 农业部兽用药物与兽医生物技术四川科学观测实验站雅安625014

运用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白(CPEP)基因,克隆至pMD-19T载体。经鉴定测序验证后,将获得的CPEP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建原核表达质粒pET-32a-CPEP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行SDS-PAG... 详细信息

运用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白(CPEP)基因,克隆至pMD-19T载体。经鉴定测序验证后,将获得的CPEP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建原核表达质粒pET-32a-CPEP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE以及Western blot分析免疫原性,纯化CPEP,并用纯化的蛋白免疫小鼠,检测其特异性血清IgG抗体水平及攻毒保护率。结果显示,成功构建原核表达质粒pET-32aCPEP;SDS-PAGE分析结果显示,得到约35ku的蛋白;Western blot分析显示,CPEP能与Hps SC-1阳性血清发生抗原抗体的特异性反应,证实该重组CPEP蛋白具有反应原性。以致死剂量的强毒株SC-1攻毒CPEP免疫小鼠,重组蛋白的免疫能够减缓发病,并表现出40%的保护率。重组蛋白CPEP的部分保护作用表明其可以作为免疫候选因子,为未来副猪嗜血杆菌标准化疫苗的研制奠定基础。

关键词：副猪嗜血杆菌荚膜多糖输出蛋白基因克隆表达免疫原性

副猪嗜血杆菌oppA基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立

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福建农林大学学报（自然科学版） 2015年第3期44卷 282-288页

作者：车勇良陈如敬江斌王隆柏魏宏吴学敏庄向生周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013

采用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌(Hps)的寡肽结合蛋白(Opp A)基因,序列测定结果表明,扩增片段全长1654 bp.将扩增片段插入表达载体p GEX-6P-1中,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组融合蛋白大小约为87 ku,以纯化的重组蛋白Op... 详细信息

采用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌(Hps)的寡肽结合蛋白(Opp A)基因,序列测定结果表明,扩增片段全长1654 bp.将扩增片段插入表达载体p GEX-6P-1中,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组融合蛋白大小约为87 ku,以纯化的重组蛋白Opp A作为抗原,建立Hps抗体的间接ELISA检测方法.通过试验确定最佳的反应条件为:抗原包被浓度为1.0μg·孔-1,于37℃包被1 h,待检血清的稀释度为1∶50,阳性判断标准(D450 nm)大于0.643.特异性和重复性试验结果表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和稳定性,可用于Hps抗体的检测.

关键词：副猪嗜血杆菌寡肽结合蛋白基因克隆表达间接ELISA

副猪嗜血杆菌vacJ基因缺失菌株构建及其生物学特性分析

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华北农学报 2017年第5期32卷 19-24页

作者：赵良友高雪丽刘超男申海龙姜南万伟泉吕晓萍郑世民东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150030 黑龙江中医药大学药物安全性评价中心黑龙江哈尔滨150040 浙江省湖州市长兴县农业局浙江湖州313100 大连大学生命科学与技术学院辽宁大连116622

为了探究副猪嗜血杆菌外膜脂蛋白编码基因vacJ在其致病中的作用,以血清5型临诊分离株HS49为研究对象,构建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ),进而比较了野生株与缺失株在生长特性、对细胞的黏附及入侵和毒力等方面的差异。结果显示,与野生株... 详细信息

为了探究副猪嗜血杆菌外膜脂蛋白编码基因vacJ在其致病中的作用,以血清5型临诊分离株HS49为研究对象,构建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ),进而比较了野生株与缺失株在生长特性、对细胞的黏附及入侵和毒力等方面的差异。结果显示,与野生株相比较,缺失vacJ后的菌株生长速率明显下降,对PK-15细胞的黏附和入侵能力则明显降低,形成生物被膜的能力也显著下降。缺失vacJ菌株对Balb/C小鼠感染模型的LD_(50)是野生株的14倍,表明vacJ基因敲除后,副猪嗜血杆菌毒力明显下降。表明vacJ基因与副猪嗜血杆菌生长、黏附入侵、生物被膜形成及毒力密切相关。

关键词：副猪嗜血杆菌 vacJ基因生物学特性毒力

副猪嗜血杆菌国内流行血清型菌株的生物学特性比较研究

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中国兽医学报 2014年第5期34卷 729-735页

作者：徐惠娟薛云赵战勤陈坤鹏王乐邓雯河南科技大学动物科技学院微生物基因工程实验室河南洛阳471003 河南科技大学医学技术与工程学院微生物检验实验室河南洛阳471003

本研究对我国最流行的HPS血清4、5、12、13和14型共16株细菌的菌体形态、生长速度、生化特性、小鼠毒力等生物学特性进行了比较研究。革兰染色镜检结果表明,除4型菌株H4L3外,同一血清型HPS的菌体形态比较一致;不同血清型HPS的菌体形态... 详细信息

本研究对我国最流行的HPS血清4、5、12、13和14型共16株细菌的菌体形态、生长速度、生化特性、小鼠毒力等生物学特性进行了比较研究。革兰染色镜检结果表明,除4型菌株H4L3外,同一血清型HPS的菌体形态比较一致;不同血清型HPS的菌体形态具有明显差异,且具有型特异性。培养结果表明,在TSA固体培养基上生长24h后的菌落平均直径大小依次为13型2.02mm、4型1.91mm、5型1.80mm、14型1.71mm、12型1.66mm,同一血清型的不同菌株之间无显著差别。生化试验结果表明不同血清型HPS的生化反应存在明显差异,即使是同一血清型的不同菌株之间也有较大差别。小鼠毒力试验结果表明,除4型外,毒力强弱依次为血清12型、14型、5型、13型,其LD50分别介于（2.7~4.6）×10^8、（4.3~7.9）×10^8、（1.0~1.3）×10^9、（2.3~2.8）×10^9 CFU之间,同一血清型的不同菌株之间无显著差别。在血清4型菌株中,H4L3的毒力明显偏强（LD50为3.6×10^8 CFU）,其他菌株的LD50介于（1.4~1.6）×10^9 CFU之间。本研究为HPS不同血清型的快速鉴定、致病机理和疫苗研发等提供了理论依据。

关键词：副猪嗜血杆菌血清型生物学特性

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5对豚鼠树突状细胞成熟及功能影响

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畜牧兽医学报 2011年第7期42卷 967-973页

作者：佘志成范红结李春玲王贵平贾爱卿杨冬霞广东省农业科学院兽医研究所广州510640 广东现代农业集团研究院广州510630 南京农业大学动物医学院南京210014

为研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白P5对豚鼠骨髓来源的树突状细胞(Dendriticcell,DC)刺激淋巴细胞增殖功能及细胞因子分泌的影响,以GM-CSF、IL-4联合诱导骨髓细胞生成未成熟DC,加入不同剂量副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5... 详细信息

为研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白P5对豚鼠骨髓来源的树突状细胞(Dendriticcell,DC)刺激淋巴细胞增殖功能及细胞因子分泌的影响,以GM-CSF、IL-4联合诱导骨髓细胞生成未成熟DC,加入不同剂量副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5,观察DC形态,检测混合淋巴细胞反应,ELISA法测IL-6、IL-12p70、TNF-α分泌情况。结果显示:经副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5刺激后,可获得具有典型树突状突起形态的DC;经5μg.mL-1P5刺激的DC较对照IL-6、TNF-α分泌量极显著增加(P0.05);50μg.mL-1P5刺激的DC较对照IL-6分泌量极显著增加(P<0.01),IL-12p70和TNF-α分泌量均极显著下降(P<0.01)。诱导后的DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力极显著增强(P<0.01)。本研究证明P5能影响骨髓细胞来源的DC的分化、成熟及功能的发挥,且不同剂量的P5对DC的成熟程度影响有差异。

关键词：副猪嗜血杆菌树突状细胞外膜蛋白P5 细胞因子

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副猪嗜血杆菌分离株的耐药性及耐药基因分析

华北农学报 2013年第4期28卷 228-233页

作者：忽占利李军星胡松华王一成袁秀芳徐丽华浙江大学动物科学学院浙江杭州310058 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

为了解浙江省规模化猪场患病猪副猪嗜血杆菌的耐药性,采用K-B琼脂法对73株HPS浙江株进行了18种临床药物的敏感性试验,同时应用PCR技术对11个相关耐药基因进行扩增、测序和比对分析。药敏试验结果显示:对磺胺类耐药的分离株比例高达86.3... 详细信息

为了解浙江省规模化猪场患病猪副猪嗜血杆菌的耐药性,采用K-B琼脂法对73株HPS浙江株进行了18种临床药物的敏感性试验,同时应用PCR技术对11个相关耐药基因进行扩增、测序和比对分析。药敏试验结果显示:对磺胺类耐药的分离株比例高达86.30%,对四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、β-内酰胺类和氯霉素类耐药的比例分别为65.75%,60.27%,50.68%,50.68%,46.58%,对大环内酯类耐药仅为28.77%。PCR分析显示:97.26%的菌株中检测到耐药基因,多重耐药的占84.93%。其中喹诺酮类耐药基因Aac(6')-1b的检出率为76.71%,氨基糖苷类耐药基因AadA1的检出率为65.75%,磺胺类耐药基因Sul1和Sul2的检出率为45.2%和10.96%,氯霉素类耐药基因Flor、CmLA、Cat1的检出率为15.07%,8.22%,58.9%,四环素类耐药基因TetA和TetB的检出率为4.11%和49.32%,β-内酰胺类耐药基因Tem-11的检出率为35.62%,大环内酯类耐药基因ErmB的检出率为1.37%。耐药基因型和表型符合率为:磺胺类62.07%,β-内酰胺类74.29%,氯霉素类81.48%,四环素类75.00%,大环内酯类0,喹诺酮类75.68%,氨基糖苷类72.09%。因此,HPS在浙江规模化猪场对临床药物已产生了耐药性,通过耐药基因检测结果确定耐药菌株具有一定的参考价值。

关键词：副猪嗜血杆菌耐药性耐药基因

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副猪嗜血杆菌外膜蛋白表型分析

中国兽医学报 2012年第11期32卷 1656-1661,1668页

作者：朱必凤杨旭夫彭凌韦昭玉韶关学院英东生命科学学院广东韶关512005 南昌大学生命科学学院江西南昌330047

采用SDS-PAGE测定了82个副猪嗜血杆菌分离株细胞外膜蛋白(OMP),比较不同临床背景分离株的OMP表型差异,分析了OMP与毒力菌株的相关性。结果表明,外膜蛋白分为3种类型:PAGE I、PAGE II和PAGEⅢ型。约34%患病猪分离株属于PAGE I型,只有约9... 详细信息

采用SDS-PAGE测定了82个副猪嗜血杆菌分离株细胞外膜蛋白(OMP),比较不同临床背景分离株的OMP表型差异,分析了OMP与毒力菌株的相关性。结果表明,外膜蛋白分为3种类型:PAGE I、PAGE II和PAGEⅢ型。约34%患病猪分离株属于PAGE I型,只有约9%健康猪分离株属于PAGE I型,说明36 000～40 000蛋白与菌株的毒力相关。

关键词：副猪嗜血杆菌外膜蛋白毒力菌株

副猪嗜血杆菌OmpA抗原表位预测、克隆及表达

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中国兽医学报 2012年第1期32卷 38-43页

作者：张东霞罗永文郭霄峰华南农业大学兽医学院广东广州510642

运用生物信息学软件DNAStar对副猪嗜血杆菌S4型OmpA的二级结构、表面特性及抗原表位等进行分析,联合重组抗原表位基因片段,并对其进行密码子改造,人工合成改造后的基因片段。将其插入pET-32a构建重组表达载体pET-pA,转化大肠杆菌BL21(DE... 详细信息

运用生物信息学软件DNAStar对副猪嗜血杆菌S4型OmpA的二级结构、表面特性及抗原表位等进行分析,联合重组抗原表位基因片段,并对其进行密码子改造,人工合成改造后的基因片段。将其插入pET-32a构建重组表达载体pET-pA,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达、鉴定及纯化。结果显示,OmpA胞外段的抗原表位分布于40～61、94～108、138～148、193～214氨基酸残基。重组后的表位基因序列与理论设计序列完全一致,表达产物为28 000大小的融合蛋白且其能与兔抗Hps S4型多抗血清特异性地反应。融合蛋白经过柱纯化并经脱盐处理后质量浓度为4～40g/L。结果表明,成功构建表达OmpA多抗原表位的重组质粒pET-pA,并对融合蛋白进行分离纯化,为单克隆抗体的制备、检测方法的建立及疫苗的研制奠定了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌 OmpA 抗原表位