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一种可用于外源基因功能鉴定的真菌分泌表达载体74HSP-EGFP的构建及验证

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基因组学与应用生物学 2021年第1期40卷 230-236页

作者：王丹彭存智常丽丽郑杏梅徐兵强仝征中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101 中国热带农业科学院海口实验站(热带果树研究所) 海口571101

传统的植物遗传转化体系能够鉴定植物基因的功能,但该过程烦琐、耗时长,且存在一定的局限性。本研究构建具有蛋白分泌信号肽和荧光蛋白EGFP的真菌分泌载体74HSP-EGFP,通过尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc... 详细信息

传统的植物遗传转化体系能够鉴定植物基因的功能,但该过程烦琐、耗时长,且存在一定的局限性。本研究构建具有蛋白分泌信号肽和荧光蛋白EGFP的真菌分泌载体74HSP-EGFP,通过尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)携带侵染巴西蕉(Musa nana)植株对载体上的外源基因功能进行快速鉴定。利用蛋白质组学技术鉴定获得来源于香蕉枯萎病致病菌Foc的主要分泌蛋白Secreted in xylem 1(SIX1d) N端分泌信号肽。基于pCT74载体、SIX1d分泌信号肽序列以及供外源基因插入的多克隆位点序列构建真菌分泌表达载体74HSP,将EGFP基因通过多克隆位点插入到该载体中获得分泌载体74HSP-EGFP。转化Foc后发现,Foc分泌载体74HSP-EGFP转化菌株在PDA培养基和KK培养基中生长4 d后,菌体中无绿色荧光信号,培养基中检测到绿色荧光信号。转化菌株侵染巴西蕉后,在植株根部组织切片中检测到绿色荧光信号。研究结果表明分泌载体74HSP-EGFP能够利用病原菌将携带的外源蛋白表达并分泌到被侵染的植物体内,实现对外源基因功能的快速分析。

关键词：分泌表达载体真菌功能验证

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一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体的构建

微生物学报 2002年第4期42卷 431-435页

作者：赵颖怡梁世中黄鲲黄日波华南理工大学食品与生物工程学院广州510640 广西大学生物技术实验中心发酵与酶工程研究所广西大学生物糖业学院南宁530005

用化学法合成克鲁维酵母的菊粉酶基因的信号肽序列 (INU) ,将其嵌入酵母附加型表达质粒pYES2 ,得到一套新型的分泌表达载体pYES2 I,pYES2 Ⅱ ,pYES2 Ⅲ。然后用PCR方法分别扩增大肠杆菌的天冬酰胺酶基因 (ASN)和短芽孢杆菌α 乙酰乳酸... 详细信息

用化学法合成克鲁维酵母的菊粉酶基因的信号肽序列 (INU) ,将其嵌入酵母附加型表达质粒pYES2 ,得到一套新型的分泌表达载体pYES2 I,pYES2 Ⅱ ,pYES2 Ⅲ。然后用PCR方法分别扩增大肠杆菌的天冬酰胺酶基因 (ASN)和短芽孢杆菌α 乙酰乳酸脱羧酶 (ALDC)基因 ,连接到INU下游 ,得到重组质粒pASN和pALDC。分别将这两个重组质粒转化酿酒酵母菌株IN VScⅠ中表达 ,胞内和胞外的酶活分析表明ASN和ALDC基因都能在酿酒酵母中分泌表达 ,表明菊粉酶信号肽序列能很好地将酿酒酵母中的重组蛋白分泌到胞外。稳定性分析表明 ,重组酵母菌株在没有选择压力的条件下连续接种培养 1 0 0h 。

关键词：酿酒酵母附加型分泌表达载体构建信号肽

***分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在***中的分泌性表达

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生物化学杂志 1995年第4期11卷 371-376页

作者：张宏权王允玲周廷冲王会信刘农乐蒋滋慧军事医学科学院基础医学研究所

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点，在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ... 详细信息

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点，在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ位点，组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－１．之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体，使之在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分泌表达，另采用ｐＩＮⅢ载体系统以分泌方式表达了人表皮生长因子。

关键词：表皮生长因子大肠杆菌分泌表达载体

鸡输卵管组织特异性分泌表达载体的构建和表达

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农业生物技术学报 2003年第1期11卷 75-78页

作者：孙明军赵晨沙金韩海棠郑克俭李赞东中国农业大学生物学院北京100094 中国农业大学生物学院

为了实现外源基因在鸡(Gallusgallus )输卵管上皮细胞内的特异性分泌表达,采用RT-PCR的方法扩增了鸡溶菌酶基因的450bp的cDNA片段,该片段保留了5ˊ端信号肽编码序列。将该片段插入到含有1.2kb卵清蛋白5ˊ调控序列的特异性表达载体pOVA-... 详细信息

为了实现外源基因在鸡(Gallusgallus )输卵管上皮细胞内的特异性分泌表达,采用RT-PCR的方法扩增了鸡溶菌酶基因的450bp的cDNA片段,该片段保留了5ˊ端信号肽编码序列。将该片段插入到含有1.2kb卵清蛋白5ˊ调控序列的特异性表达载体pOVA-GFP中,与绿色荧光蛋白基因形成融合基因,使融合蛋白具有分泌功能。新构建的分泌表达载体pOVALG转染鸡胚成纤维细胞和大鼠乳腺上皮细胞系SHZ-88后,成功地检测到了绿色荧光蛋白的表达。

关键词：卵清蛋白5ˊ调控序列分泌表达载体溶菌酶绿色荧光蛋白

人bFGF卵清蛋白分泌表达载体的构建及分析

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黑龙江医药 2010年第3期23卷 328-331页

作者：王海军王艳芳江莺赵文杰任艳马吉胜吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心吉林长春130118

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的卵清蛋白分泌表达载体,为建立鸡输卵管生物反应器奠定基础。方法:利用PCR手段,从鸡基因组DNA克隆了4.1k(-4050bp～+42bp)卵清蛋白(ovalbumin)上游调控序列,... 详细信息

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的卵清蛋白分泌表达载体,为建立鸡输卵管生物反应器奠定基础。方法:利用PCR手段,从鸡基因组DNA克隆了4.1k(-4050bp～+42bp)卵清蛋白(ovalbumin)上游调控序列,利用重叠PCR技术,将溶菌酶信号肽(lysozyme signal peptide)基因与人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因融合在一起。结果:经DNA测序和核酸电泳检测,OV启动子基因序列、pcsbFGF和pcOV-sbFGF电泳位点与预计结果一致。结论:人bFGF的卵清蛋白分泌表达载体构建初步完成,可进行进一步转染表达。

关键词： bFGF 卵清蛋白分泌表达载体生物反应器

分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗菌株的筛选

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中华结核和呼吸杂志 2005年第4期28卷 254-257页

作者：师长宏徐志凯朱德生李元柏银兰薛莹第四军医大学基础部微生物学教研室西安710033

目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗(BCG)菌株。方法采用多聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60(Hsp60)基因及其信号肽序列αss,将测序正确的hsp60和αss基因分别克隆入大肠杆菌(***.... 详细信息

目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗(BCG)菌株。方法采用多聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60(Hsp60)基因及其信号肽序列αss,将测序正确的hsp60和αss基因分别克隆入大肠杆菌(***.)BCG穿梭载体pOLYG中,构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22,按相应的酶切位点将ag85b和esat6按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体,分别命名为pDE22Ag85B ESAT6和pDE22ESAT6Ag85B,将纯化的重组质粒电穿入BCG,经潮霉素抗性筛选和PCR的方法鉴定出含目的基因的重组BCG阳性克隆。收集重组BCG的培养上清液,经浓缩和透析后,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和固相化蛋白质免疫学测定(Western blot法)分析。结果两株重组BCG菌株的培养上清液分泌表达相对分子质量约37000的蛋白,且分别可与抗Ag85B和抗ESAT6蛋白免疫小鼠的血清有相应的结合条带。结论分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组BCG菌株构建成功,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。

关键词： Ag85B 融合蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳重组卡介苗 Western-blot法菌株聚合酶链反应(PCR) 卡介苗(BCG) 重组BCG ESAT6蛋白培养上清液结核分枝杆菌分泌表达载体相对分子质量信号肽序列热休克蛋白 H37Rv

MMP-9信号肽高效诱导PEX重组蛋白在COS7细胞中分泌表达

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中国生物工程杂志 2007年第5期27卷 1-5页

作者：宋琳张志谦北京大学临床肿瘤学院/北京市肿瘤防治研究所北京100036

为了便于收集和纯化,重组蛋白常需要引导至真核细胞外。蛋白能否分泌主要取决于其是否含有信号肽,由于不同信号肽诱导蛋白分泌的效率不同,高效信号肽的筛选已成为生物工程领域提高重组蛋白产量的重要策略之一。为了筛选诱导MMP-2C末端PE... 详细信息

为了便于收集和纯化,重组蛋白常需要引导至真核细胞外。蛋白能否分泌主要取决于其是否含有信号肽,由于不同信号肽诱导蛋白分泌的效率不同,高效信号肽的筛选已成为生物工程领域提高重组蛋白产量的重要策略之一。为了筛选诱导MMP-2C末端PEX在COS7细胞中高效分泌表达的信号肽,在PEX的N末端分别融合大鼠生长激素(rGH)、小鼠IgGκ链和人基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase9,MMP-9)的信号肽并比较三种信号肽引导PEX分泌表达的效率。Western免疫印迹和ELISA蛋白定量检测表明MMP-9的信号肽引导PEX蛋白分泌的效率约为其它两种信号肽的两倍。利用Ni-NTA亲和柱对细胞培养基中的PEX进行纯化,蛋白产量约为1mg/L,纯化的PEX重组蛋白具有抑制鸡尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)血管发生的作用。以上结果提示MMP-9的信号肽有效诱导具有生物活性的PEX重组蛋白在COS7细胞中分泌表达。

关键词：基质金属蛋白酶-9 信号肽分泌表达载体 PEX

真核双基因表达载体pIRES-IL-24-ES的构建与鉴定

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山东大学学报（医学版） 2010年第3期48卷 78-82页

作者：韩建军胡三元智绪亭梁晓红薛德文山东大学齐鲁医院普通外科济南250012 山东大学医学院免疫学实验室济南250012 山东省肿瘤医院肿瘤介入治疗中心济南250117

目的构建白介素24(IL-24)与内皮抑素(ES)的真核双基因表达载体,检测它们在体外的表达。方法从外周血和人胎肝组织中经RT-PCR分别扩增IL-24与EScDNA序列,并将其定向克隆至真核双基因表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-IL-24-ES,经酶切及测... 详细信息

目的构建白介素24(IL-24)与内皮抑素(ES)的真核双基因表达载体,检测它们在体外的表达。方法从外周血和人胎肝组织中经RT-PCR分别扩增IL-24与EScDNA序列,并将其定向克隆至真核双基因表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-IL-24-ES,经酶切及测序鉴定后,转染NIH3T3成纤维细胞。经RT-PCR及ELISA法检测IL-24和ES在NIH3T3中的表达。结果重组真核双基因表达载体pIRES-IL-24-ES构建成功,IL-24与ES可在NIH3T3细胞中有效表达。结论真核双基因表达载体pIRES-IL-24-ES成功构建为研究肿瘤的基因治疗提供了一定线索。

关键词：白介素-24 内皮抑素分泌表达载体肿瘤

乳酸乳球菌启动子-信号肽活性片段的克隆和表达

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云南大学学报（自然科学版） 1999年第S3期21卷 352-352页

作者：陈秀珠刘宗旨吴茜陈美玲还连栋中国科学院微生物研究所北京100080