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食品工业科技 2012年第5期33卷 167-169,173页

作者：畅晓洁郑必胜赵欣华南理工大学轻工与食品学院广东广州510640

采用恒温摇床培养法培养裂褶菌,研究了裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶培养基组成中的碳源、氮源及各种无机盐的单因素参数,并采用四因素三水平正交实验对主要影响因素进行分析,从而确定最佳的产酶培养基配方为:葡萄糖2%,牛肉膏0.3%,NH4Cl0... 详细信息

采用恒温摇床培养法培养裂褶菌,研究了裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶培养基组成中的碳源、氮源及各种无机盐的单因素参数,并采用四因素三水平正交实验对主要影响因素进行分析,从而确定最佳的产酶培养基配方为:葡萄糖2%,牛肉膏0.3%,NH4Cl0.1%,KH2PO40.05%,MgSO40.05%。

关键词：裂褶菌内切β-1 3-葡聚糖酶培养基组成

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一株拮抗芽孢杆菌的分离鉴定及其β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆

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科技导报 2012年第27期30卷 20-23页

作者：吴慧玲刘伟成卢彩鸽董丹张殿鹏张涛涛北京市农林科学院植物保护环境保护研究所北京100097

植物真菌病害是影响农业生产的主要因素之一,连作栽培导致病害逐年加重,为获得能够抑制病原真菌的生防菌以解决真菌病害防治难题,通过平板对峙实验及分子鉴定、抑菌活性物质分析、葡聚糖酶基因克隆及分析,获得一株对多种植物病原真菌具... 详细信息

植物真菌病害是影响农业生产的主要因素之一,连作栽培导致病害逐年加重,为获得能够抑制病原真菌的生防菌以解决真菌病害防治难题,通过平板对峙实验及分子鉴定、抑菌活性物质分析、葡聚糖酶基因克隆及分析,获得一株对多种植物病原真菌具有显著抑制作用的芽孢杆菌,菌株编号为L103。16S rDNA及看家基因序列分析表明,该菌株为巨大芽孢杆菌,羧甲基纤维素钠平板筛选及刚果红染色实验发现该菌具有很强的产纤维素酶(CMC酶)的能力,根据GenBank中巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因(HM130670.1)序列设计引物,将扩增得到的1482bp大小的片段克隆到载体pMD18-T上,测序并通过GenBank数据库BLAST分析显示该序列与一株Bacillus ***102的内切β-1,4-葡聚糖酶基因序列一致性达到95%,而与Bacillus subtilis的β-1,4-内切葡聚糖酶基因一致性为85%,进一步分析该菌株产生的抗病活性物质并对其进行改良将为该菌在今后的真菌病害防治应用中提供理论基础。

关键词：巨大芽孢杆菌 16S rDNA 内切β-1 4-葡聚糖酶

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野油菜黄单胞杆菌纤维素酶基因原核表达及其固定化研究

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作者：王开胜上海交通大学

学位级别：硕士

纤维素(cellulose)是葡萄糖经β-1,4-糖苷键连接而成的不溶性的结晶多糖物质,每年估计合成4×10吨,因而是一种有潜力解决能源,化学,食品等短缺问题的可再生资源[1]。纤维素酶(cellulases)是一类重要的能降解木质纤维素的复合酶,已广泛... 详细信息

纤维素(cellulose)是葡萄糖经β-1,4-糖苷键连接而成的不溶性的结晶多糖物质,每年估计合成4×10吨,因而是一种有潜力解决能源,化学,食品等短缺问题的可再生资源[1]。纤维素酶(cellulases)是一类重要的能降解木质纤维素的复合酶,已广泛应用于能源、纺织、印染、造纸、洗涤、食品、饲料、酿酒等多个行业。微生物产生的纤维素酶分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径。纤维素酶( Cellulase)是糖苷水解酶的一类,是指能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。狭义的纤维素酶可分为3类:外切葡聚糖酶(EC 3.***.1.91)、内切葡聚糖酶(EC 3.***.1.4)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.***.1.21);其中,内切型纤维素酶,又名内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-D-glucanase EC 3.***.1.4),在纤维素酶体系中最为重要,能随机地水解纤维素分子上的β-1,4-糖苷键,将长链的纤维素分子降解成为小分子纤维素,直到彻底降解为纤维二糖[2]. 本实验采用了植物病原菌黄单胞杆菌来源的纤维素酶进行了研究,得到了纯度较高的纤维素酶,测定了其水解活性,然后进行了固定化的一些研究,这对于后面工作的开展奠定了基础。主要研究结果如下: 1纤维素酶基因的克隆与表达根据NCBI中野油菜黄单胞杆菌纤维素酶基因设计特异性引物,PCR克隆了其内切葡聚糖基因XC639。根据文库构建的思路,采用了同源引物来减少花费,使用CPEC(Circular Polymerase ExtensionCloning)的方法将其克隆到表达载体pET28a质粒上,在大肠杆菌rosetta中诱导表达,得到的蛋白利用其上携带的6×HIS使用NI柱进行亲和纯化,SDS-PAGE检测,该蛋白在52.2KD处有一条清晰的条带,测定蛋白浓度为1mg·ml。而且只有删除信号肽后,方可非变性纯化得到蛋白。 2纯化酶的固定化研究使用了共价键的方式,蛋白与树脂进行了牢固的结合,蛋白固定效率可达70%,活性保留60%。固定化蛋白的热稳定性更高,pH受树脂本身负电荷的影响,往碱性方向移动。 3游离与固定化纤维素酶的酶学性质分析该蛋白比活为60U·mg,固定前后最适温度为53℃与62℃,最适pH为5.4与5.8,固定化酶对热更稳定,并向偏碱性pH方向偏移,动力学常数分别为Vmax:411umol·ml·h与383umol·ml·h,Km:0.2500%与0.3125%。

关键词：黄单胞杆菌纤维素酶内切β-1 4-葡聚糖酶固定化酶

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