野油菜黄单胞杆菌纤维素酶基因原核表达及其固定化研究

作     者：王开胜 

作者单位：上海交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邵志峰;刘建华

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：黄单胞杆菌 纤维素酶 内切β-1 4-葡聚糖酶 固定化酶 

摘      要：纤维素(cellulose)是葡萄糖经β-1,4-糖苷键连接而成的不溶性的结晶多糖物质,每年估计合成4×10吨,因而是一种有潜力解决能源,化学,食品等短缺问题的可再生资源[1]。纤维素酶(cellulases)是一类重要的能降解木质纤维素的复合酶,已广泛应用于能源、纺织、印染、造纸、洗涤、食品、饲料、酿酒等多个行业。微生物产生的纤维素酶分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径。 纤维素酶( Cellulase)是糖苷水解酶的一类,是指能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。狭义的纤维素酶可分为3类:外切葡聚糖酶(EC 3.***.1.91)、内切葡聚糖酶(EC 3.***.1.4)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.***.1.21);其中,内切型纤维素酶,又名内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-D-glucanase EC 3.***.1.4),在纤维素酶体系中最为重要,能随机地水解纤维素分子上的β-1,4-糖苷键,将长链的纤维素分子降解成为小分子纤维素,直到彻底降解为纤维二糖[2]. 本实验采用了植物病原菌黄单胞杆菌来源的纤维素酶进行了研究,得到了纯度较高的纤维素酶,测定了其水解活性,然后进行了固定化的一些研究,这对于后面工作的开展奠定了基础。 主要研究结果如下: 1纤维素酶基因的克隆与表达 根据NCBI中野油菜黄单胞杆菌纤维素酶基因设计特异性引物,PCR克隆了其内切葡聚糖基因XC639。根据文库构建的思路,采用了同源引物来减少花费,使用CPEC(Circular Polymerase ExtensionCloning)的方法将其克隆到表达载体pET28a质粒上,在大肠杆菌rosetta中诱导表达,得到的蛋白利用其上携带的6×HIS使用NI柱进行亲和纯化,SDS-PAGE检测,该蛋白在52.2KD处有一条清晰的条带,测定蛋白浓度为1mg·ml。而且只有删除信号肽后,方可非变性纯化得到蛋白。 2纯化酶的固定化研究 使用了共价键的方式,蛋白与树脂进行了牢固的结合,蛋白固定效率可达70%,活性保留60%。固定化蛋白的热稳定性更高,pH受树脂本身负电荷的影响,往碱性方向移动。 3游离与固定化纤维素酶的酶学性质分析 该蛋白比活为60U·mg,固定前后最适温度为53℃与62℃,最适pH为5.4与5.8,固定化酶对热更稳定,并向偏碱性pH方向偏移,动力学常数分别为Vmax:411umol·ml·h与383umol·ml·h,Km:0.2500%与0.3125%。