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新疆野生盘羊ISG15基因的克隆表达

畜牧兽医学报 2013年第7期44卷 1023-1029页

作者：鲁海富沈文刘恺崔茹鹏杨文姜方配孙延鸣石河子大学动物科技学院石河子832003 乌鲁木齐市动物园乌鲁木齐830094

本研究旨在克隆表达新疆野生盘羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。首先,利用RT-PCR和RACE技术克隆盘羊ISG15基因的cDNA全长序列,再将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni 2+螯合... 详细信息

本研究旨在克隆表达新疆野生盘羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。首先,利用RT-PCR和RACE技术克隆盘羊ISG15基因的cDNA全长序列,再将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni 2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,最后通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的新疆野生盘羊ISG15基因cDNA全长为642bp,开放阅读框为474bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33ku,表达的蛋白可用Ni 2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P表达的蛋白具有生物学活性。

关键词：野生盘羊 ISG15 克隆表达活性检测

天冬氨酸激酶突变体G277K中AK基因的克隆表达及酶学性质表征

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食品科学 2014年第11期35卷 149-154页

作者：任军闵伟红詹冬玲方丽李慧颖朱运明吉林农业大学食品科学与工程学院小麦和玉米深加工国家工程实验室吉林长春130118

通过序列比对和晶体结构分析发现,天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)的G277位点高度保守,并与抑制剂Thr通过氢键相连,对其进行定点突变和酶学性质表征。结果表明:突变体G277K的AK最适反应条件是30℃、pH 8.5;动力学实验结果显示突变体AK... 详细信息

通过序列比对和晶体结构分析发现,天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)的G277位点高度保守,并与抑制剂Thr通过氢键相连,对其进行定点突变和酶学性质表征。结果表明:突变体G277K的AK最适反应条件是30℃、pH 8.5;动力学实验结果显示突变体AK的正协同效应降低,趋向于米氏酶,参数S0.5、nH、酶比活力、Vmax分别是7.05 mmol/L,1.24、964.3 U/mg、32.143 U/(mg·min);热稳定性实验显示,其30℃半衰期为2.3 h,3 h后酶活力丧失80%左右;Ni2+在低浓度时表现出显著的激活效应;有机溶剂丙三醇、异丙醇和二甲基亚砜的体积分数为1%时,对AK的酶活力有很好的激活作用,表明突变体AK对一些有机溶剂有一定的抗性;低浓度的赖氨酸和蛋氨酸对AK有激活作用。

关键词：天冬氨酸激酶克隆表达定点突变酶学性质

绿色糖单孢菌高产麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质

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应用与环境生物学报 2013年第2期19卷 342-345页

作者：汪小波李美蓉李雪黄坚丽黄英杜丽琴黄日波韦宇拓广西大学生命科学与技术学院南宁530005 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530005 国家非粮生物质能源研究工程中心南宁530007

为开发新型淀粉酶,鉴定了来自绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)在Genbank中注释为糖苷酶(Glycosidase)的一个ORF,研究表明该ORF编码一种α-淀粉酶.重组酶酶学性质的研究表明以可溶性淀粉为底物反应的最适pH为6.6,在pH 5.6-8.6有... 详细信息

为开发新型淀粉酶,鉴定了来自绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)在Genbank中注释为糖苷酶(Glycosidase)的一个ORF,研究表明该ORF编码一种α-淀粉酶.重组酶酶学性质的研究表明以可溶性淀粉为底物反应的最适pH为6.6,在pH 5.6-8.6有80%以上的相对活力,最适温度为60℃,比活力为319.49 U/mg.它与可溶性淀粉、六糖、五糖、四糖、三糖反应,经HPLC检测产物均为麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物.重组酶与20%的可溶性淀粉反应,产物含有高达67.15%的麦芽糖,还原糖的转化率约为75%,加入普鲁兰酶后,麦芽糖含量增加到69.7%,还原糖转化率约为91%,不能与麦芽糖、α-环糊精、β-环糊精和普鲁兰糖反应.

关键词：绿色糖单孢菌 α-淀粉酶克隆表达麦芽糖酶学性质

中国莱姆病螺旋体FP1外膜蛋白A的克隆表达及其抗原性的初步研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第8期24卷 615-617页

作者：郝琴万康林中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京102206

目的　克隆并表达中国莱姆病螺旋体阿弗西尼疏螺旋体基因种参照菌株FP1的外膜蛋白A(OspA) ,并对其抗原性进行初步研究和基因序列分析 ,为研制中国莱姆病疫苗提供资料。方法设计引物 ,用聚合酶链反应 (PCR)从莱姆病螺旋体FP1全基因组DNA... 详细信息

目的　克隆并表达中国莱姆病螺旋体阿弗西尼疏螺旋体基因种参照菌株FP1的外膜蛋白A(OspA) ,并对其抗原性进行初步研究和基因序列分析 ,为研制中国莱姆病疫苗提供资料。方法设计引物 ,用聚合酶链反应 (PCR)从莱姆病螺旋体FP1全基因组DNA中扩增出OspA编码基因 ,经酶切、连接 ,插入原核表达载体pET 11d ,构成重组质粒pET 11d ospA ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,表达产物用SDS PAGE、Westernblot分析 ,并进行基因序列测定。结果　rOspA在宿主菌内获得高效、稳定表达 ;相对分子质量 (Mr)约为 31× 10 3,Westernblot显示其与抗OspA的多抗有良好的免疫反应性 ;经测序显示该rOspA的基因片段长度为 783bp ,编码 2 6 1个氨基酸 ,与欧洲标准菌株Pko和瑞士标准菌株VS4 6 1的OspA的DNA碱基序列比较 ,同源性均为 94 %。结论　在国内首次成功地对中国莱姆病螺旋体阿弗西尼疏旋体基因种的代表菌株FP1的OspA基因进行了克隆和表达。并且证实rOspA有良好的抗原性 ,可进一步对其免疫保护性进行研究 ,以便为研制有效的莱姆病疫苗提供数据。

关键词：中国莱姆病螺旋体FP1 外膜蛋白A 克隆表达抗原聚合酶链反应 PCR

东亚飞蝗主要过敏原精氨酸激酶基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

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应用昆虫学报 2013年第1期50卷 133-138页

作者：陈义昆邬玉兰李荔连国云刘志刚深圳大学生命科学学院深圳518060 深圳大学医学院深圳518060

本研究克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因全长,表达并纯化重组AK蛋白,研究重组蛋白的免疫反应性。东亚飞蝗AK基因开放阅读框全长为1 068 bp,编码355个氨基酸,与GenBank中已登录的... 详细信息

本研究克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因全长,表达并纯化重组AK蛋白,研究重组蛋白的免疫反应性。东亚飞蝗AK基因开放阅读框全长为1 068 bp,编码355个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗AK(DQ513322)基因同源性为98%,重组质粒pET-28a-AK在E.coli中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为40 000,主要以可溶性形式表达,经亲和层析获得重组蛋白。通过免疫印迹分析结果表明,重组AK蛋白可被过敏性患者血清识别,免疫原性良好。结果表明我们成功获得东亚飞蝗精氨酸激酶全长基因并表达出重组AK蛋白,重组AK蛋白具有良好的免疫反应性。

关键词：东亚飞蝗精氨酸激酶过敏原克隆表达纯化

安氏隐孢子虫ABC2基因的克隆表达与营养物质转运

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中国农业大学学报 2017年第10期22卷 97-102页

作者：王菊花王佳明刘丹丹王攀周杰薛秀恒安徽农业大学动物科技学院合肥230036 安徽农业大学茶与食品学院合肥230036

为探究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒转运蛋白基因(CaABC2)对营养物质的转运功能,以安氏隐孢子虫基因组作为模板,设计合成CaABC2基因特异性引物,进行PCR扩增,获得CaABC2基因。将克隆的重组质粒CaABC2基因与真核表... 详细信息

为探究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒转运蛋白基因(CaABC2)对营养物质的转运功能,以安氏隐孢子虫基因组作为模板,设计合成CaABC2基因特异性引物,进行PCR扩增,获得CaABC2基因。将克隆的重组质粒CaABC2基因与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切后再连接,构建重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2;再采用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-C1-CaABC2转入小鼠肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC),检测不同组IEC细胞对总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的转运效果。结果表明:扩增出778bp的CaABC2基因,测序分析与预期片段大小一致;重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2转染小鼠IEC细胞后,观察到转染后的对照组和转染组IEC有绿色荧光;检测到在细胞内液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别为15.99±0.12、11.80±0.35和12.43±0.16 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为15.24±0.44、10.48±0.35和11.04±0.75mmol/L;在细胞外液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别10.67±0.17、14.82±0.06和15.84±0.17 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为10.20±0.79、14.60±0.45和15.60±2.50mmol/L。转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽浓度均显著大于空白组和对照组(P0.05);转染组、对照组和空白组之间的葡萄糖和碱性磷酸酶浓度均没有统计学差异(P>0.05)。CaABC2基因具有协助转运总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的作用,其中转运总胆固醇效果最为明显。

关键词：安氏隐孢子虫 ATP结合盒式转运蛋白2 克隆表达营养转运

一种海洋来源蜡样芽孢杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆表达及功能鉴定

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大连海洋大学学报 2021年第1期36卷 44-50页

作者：江超峰李悝悝李唐车佳尹恒中科院大连化学物理研究所辽宁省碳水化合物重点实验室大连市糖类农用制剂工程研究中心辽宁大连116023 中国科学院大学化学科学学院北京100049 大连海洋大学食品科学与工程学院辽宁大连116023

为获得高效的α-半乳糖苷酶并了解其功能,采用基因工程技术,从鹿角菜中筛选获得的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus中克隆得到一个新的α-半乳糖苷酶基因(BcgalA),并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功进行了重组表达。结果表明:BcgalA基... 详细信息

为获得高效的α-半乳糖苷酶并了解其功能,采用基因工程技术,从鹿角菜中筛选获得的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus中克隆得到一个新的α-半乳糖苷酶基因(BcgalA),并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功进行了重组表达。结果表明:BcgalA基因序列编码441个氨基酸,预测的BcGalA蛋白相对分子质量约为50380,生物信息学分析显示,该酶属于GH4家族;酶活试验表明,在37℃、pH 8.0条件下该酶水解4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNP-α-Gal)、棉子糖的比活力分别为(1.498±0.034)、(0.261±0.012)U/mg,但对半乳甘露聚糖无水解活性。研究表明,本研究中克隆表达的BcGalA是一种属于GH4中仅对低分子量底物起作用的α-半乳糖苷酶,为探究GH4α-半乳糖苷酶的结构与功能关系提供了样本。

关键词：蜡样芽孢杆菌 α-半乳糖苷酶 GH4 克隆表达催化机制

桃拉综合征病毒CP2蛋白的克隆表达及其结合肽的噬菌体肽库筛选

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中国免疫学杂志 2013年第11期29卷 1155-1160页

作者：黄新新陆承平孔繁德蔡强浙江清华长三角研究院生态环境研究所嘉兴314006 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095 厦门出入境检验检疫局厦门361012

目的：克隆表达出桃拉综合征病毒（TSV）主要衣壳蛋白CP2蛋白,并通过对噬菌体随机肽库的淘选,得到与CP2蛋白结合的相关多肽,以探讨CP2蛋白与配体作用的特异位点。方法：根据重组质粒pMD-CP2的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,扩增TSV ... 详细信息

目的：克隆表达出桃拉综合征病毒（TSV）主要衣壳蛋白CP2蛋白,并通过对噬菌体随机肽库的淘选,得到与CP2蛋白结合的相关多肽,以探讨CP2蛋白与配体作用的特异位点。方法：根据重组质粒pMD-CP2的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,扩增TSV CP2基因高变区376~1 371 bp,扩增片段插入pET-32构建成原核表达载体pET-CP2。该重组载体在IPTG诱导下进行可溶性表达,SDS-PAGE电泳检测表达的CP2蛋白。以纯化的CP2蛋白作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行亲和淘选。结果：原核表达出56 kD大小的CP2蛋白,对噬菌体12肽库4轮＂吸附-洗脱-扩增＂淘洗后,所得的噬菌体回收率逐步提高,由6.4×10-5上升到2.8×10-2,显示淘选过程对随机肽库有很好的富集效果。随机挑选第4轮淘筛后的36个单克隆噬菌体,ELISA鉴定有24个单克隆（66.6%）为强阳性。将这24个阳性克隆扩增、测序,推导随机多肽的氨基酸序列。分析发现,有7个克隆（克隆号2、6、7、9、18、20、33）完全一致,序列为HTSFCSTHLCLI,其它的几个克隆如克隆3及28序列为HCSNLFCSLDLP;克隆5为HCSHTLCALHVM;克隆26为HCNSWLCPLITD也与该7个克隆有相似的序列,经比对核心序列为HCS及LCL。结论：首次用重组的TSV CP2蛋白从噬菌体随机12肽库中筛选到特异结合的肽序列,其共有结构特征为明确CP2与结合蛋白的相互作用位点提供支持。

关键词：桃拉综合征病毒(TSV) CP2蛋白克隆表达噬菌体展示肽库配体

基因C型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

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浙江农业学报 2011年第2期23卷 258-262页

作者：赵立娜崔言顺任建亭李建亮黄兵李玉峰马秀丽山东农业大学动物医学院山东泰安271018 山东省农业科学院家禽研究所山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室山东济南250023 山东省东营市广饶县中等专业中学山东广饶257300

采用RT-PCR方法,扩增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建新型DHVVP1基因克隆重组质粒。然后将VP1基因定向插入到pET-32a(+)表达载体中,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,基因C... 详细信息

采用RT-PCR方法,扩增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建新型DHVVP1基因克隆重组质粒。然后将VP1基因定向插入到pET-32a(+)表达载体中,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,基因C型DHV-VP1基因可在大肠杆菌中稳定高效的表达。Western-blot检测表明,表达产物可与基因C型DHV阳性血清发生特异性反应。将纯化的重组蛋白免疫4周龄SPF鸡,以纯化的VP1重组蛋白和基因C型DHV全病毒分别包板,制备的抗血清ELISA效价分别可达1∶25 600,1∶51 200,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。

关键词：鸭肝炎病毒基因C型 VP1基因克隆表达多克隆抗体