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基于恒温非酶核酸信号扩增的适配体传感器

基于恒温非酶核酸信号扩增的适配体传感器

作者：杨蕾武汉大学

学位级别：硕士

生物小分子包括短链核酸,有机小分子,低分子量蛋白质等,在生物体和细胞中调节多种生化反应和细胞代谢过程,其异常的表达水平可以指示多种疾病,在分析化学及临床医学领域中具有重要的研究意义。然而,生物小分子在细胞和组织中表达水平都... 详细信息

生物小分子包括短链核酸,有机小分子,低分子量蛋白质等,在生物体和细胞中调节多种生化反应和细胞代谢过程,其异常的表达水平可以指示多种疾病,在分析化学及临床医学领域中具有重要的研究意义。然而,生物小分子在细胞和组织中表达水平都比较低,传统的目标物与信号输出单元一对一的传感手段已无法满足检测灵敏度的需要,核酸信号扩增技术为生物小分子的高灵敏检测提供了广阔的前景。适配体通常是从体外筛选获得的一类单链寡核苷酸(RNA或DNA),它能够与靶标配体以高特异性和高亲和力结合。与传统的蛋白抗体相比较,适配体具有识别的靶标物广泛、易于合成和修饰、成本低、化学稳定性好等优点,使得适配体可以作为识别元件设计用于生物分子检测,这种结合适配体与核酸信号扩增构建的新型生物分析方法具有高灵敏度、高选择性的优点,但目前适配体传感器由于引入蛋白酶或纳米材料,导致检测成本高,方法繁琐,灵敏度较低。本论文构建了两种级联的恒温非酶(非蛋白酶)核酸信号扩增技术(HCR-HCR,CHA-DNAzyme),并通过设计“即插即用”的模块化组件构建了通用的传感体系。研究工作主要从以下两个方面展开:(1)通过整合连续的两级杂交链式反应(HCR)线路构建基于适配体的级联杂交链式反应(C-HCR)放大器,用于三磷酸腺苷(ATP)和凝血酶的分析。在该策略中,设计了上游HCR-1线路和下游HCR-2线路。适配体序列整合在上游HCR-1的引发剂序列中,同时引入相应的抑制剂同时与部分适配体和引发剂序列杂交,以避免信号泄漏。靶标分子可以与适配体特异性结合并形成一定空间结构,进而释放引发剂触发C-HCR反应,实现N倍放大的“signal-on”读出信号。此外,该方法通过引入不同的适配体序列和相应的抑制剂作为模块化组件可构建检测生物小分子的通用适配体传感体系,具有普适性。(2)通过将催化发夹自组装(CHA)线路与DNAzyme介导的放大器偶联,开发了恒温非酶的CHA-DNAzyme体系用于核酸分析。靶标分子催化两种功能性发夹杂交形成大量的哑铃型DNAzyme复合物,在有Mg存在时,DNAzyme循环剪切底物链,产生扩增信号。此外,通过设计引入辅助发夹作为模块化组件很容易的实现各种microRNA(miRNA)分析的通用传感体系。我们通过采用不同的DNAzyme催化单元(hemin/G-quadruplex HRP模拟酶),进一步设计免标记的CHA-DNAzyme体系,通过催化HO氧化ABTS实现比色信号转换。CHA-DNAzyme荧光体系通过转染试剂的辅助可在活细胞内成像miRNA,实现更多的生物分析和生物医学应用。

关键词：生物小分子适配体信号扩增生物传感核酸酶

基于信号扩增策略构建的高灵敏荧光适体传感器用于检测腺苷

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基于信号扩增策略构建的高灵敏荧光适体传感器用于检测腺苷

作者：孙杰威山东大学

学位级别：硕士

生物传感器是将目标物识别过程转换成信号并有效输出的一种快速检测和监控装置,其在许多领域有着广泛的应用,如药物分析、生物技术、环境保护和临床诊断等。适体的介入为传感器的研究发展提供了新的动力。由于其高特异性和高结合力的固... 详细信息

生物传感器是将目标物识别过程转换成信号并有效输出的一种快速检测和监控装置,其在许多领域有着广泛的应用,如药物分析、生物技术、环境保护和临床诊断等。适体的介入为传感器的研究发展提供了新的动力。由于其高特异性和高结合力的固有性质,以适体为识别元素的传感器成为近年来研究的热点。到目前为止,多种信号转导的适体传感器已经被建立,其中,荧光适体传感器因其仪器设备操作简单、灵敏度高、选择性好、响应快速、且对样品不会造成破坏等优点,得到广泛应用。本文的研究工作是利用生物化学分析的新技术构建新型的荧光适体传感器用于检测目标物。腺苷是一种内源性核苷,同时也是重要的药物小分子,在生理和药理方面发挥着重要作用,如舒张血管、控制平滑肌收缩等,是人体生理活动的重要调节者。其在中枢神经系统、周围神经系统和免疫系统中均起着重要的作用。此外,据文献报道,腺苷还可作为癌症的潜在标志物。因此,腺苷的检测对心血管疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤的诊断和治疗等方面都具有重要的意义[153-159]目前,大量的腺苷适体传感体系已被构建用于腺苷的分析检测,然而由于腺苷在正常人尿液和血清中含量极低,它们的灵敏度往往不够理想,不能直接用于复杂生物样本(人尿液和血清)中腺苷的定量检测(据报道正常人尿样中腺苷浓度范围在2.0×10-6mol L-1到7.0×10-6mol L-1之间,血清中腺苷浓度范围在5.0×10-8mol L-1到1.0×10-7 mol L-1之间)[176,178]。而生物样本中腺苷的检测在临床研究和疾病的诊断和预防方面具有较高的临床应用意义,例如生理条件下腺昔含量的波动可用于心、脑生理功能的研究,尿液中腺苷含量的升高可用于肿瘤的早期诊断。因此,如何提高传感器的灵敏度,并实现复杂生物样本中低腺苷含量的检测是目前腺苷检测面临的重要问题。本文利用高效的信号扩增策略,构建了新颖且通用的荧光适体传感器,使腺苷的灵敏度有了很大提高,并可达到生物样品中的定量检测。本文第一章为绪论部分,首先对生物传感器进行了概述,并着重介绍了荧光适体传感器的特点、优势和应用前景;其次,对常用的信号扩增策略进行了概述;最后,介绍了腺苷检测的意义、现有方法、腺苷适体传感器及面临问题。本文第二章,利用外切酶III辅助的DNA循环和杂交链反应(HCR)的双重放大作用,构建了一种免标记且灵敏的荧光适体传感器用于检测腺苷。在该方案中,首先设计了一个包含催化链、适体链和链霉亲和素化磁球的三功能探针。当目标物被适体链识别之后,催化链会立即被释放。然后,催化链触发Exo Ⅲ辅助的DNA循环,产生大量的DNA片段,从而获得第一次放大。随后,DNA片段作为触发链引发HCR,形成带有许多G-四分体结构的双螺旋,获得了第二次放大。最终,荧光染料N-甲基卟啉二丙酸IX (NMM)插入到G-四分体结构中,产生增强的荧光响应,实现了免标记的检测。该方法的检测限为4.2×10-7 mol|1。此外,该方法特异性良好,并且能够区分癌症病人和正常人尿样中腺苷的含量,为腺苷的检测提供了一种新的可靠的定量方法。虽然上述构建的适体传感器成功且灵敏的对腺苷进行了检测,但是,在实验过程中,为了获得低背景信号,我们引入了磁球对目标物进行富集和分离。然而,磁球的引入需要对其进行修饰、活化和分离,这无疑增加了操作上的复杂性和实验的成本。为此,我们展开了下一个工作,也就是本文的第三章,利用聚合切刻循环反应和发卡结构催化自组装(CHA)的双重扩增机制,构建了一种均相中检测腺苷的新方法。该方法设计了一个含有腺苷适体、切刻酶识别位点和CHA触发链互补碱基的发卡探针。当目标物存在时,适体识别腺苷使得发卡探针构象发生改变,在聚合酶、dNTPs和切刻酶的作用下,发生聚合切刻循环反应,产生大量单链DNA;此步为第一次扩增;然后,单链DNA作为CHA的引物链,触发CHA生成大量带有G-四分体的双链DNA,此步为第二次扩增;最终插入荧光染料NMM,实现荧光信号的免标记检测,检测限达到1.3×10-7 mol L-1。该检测限比其他检测腺苷的免标记方法降低了两个数量级[171,175],较本课题组降低了约50倍[148]。该方法可实现均相中免标记、免分离且双重放大的腺苷检测,同样能区分癌症病人和正常人尿样中腺昔的含量,且比之本文第二章,灵敏度有了进一步的提高,在均相中进行操作使得方法更加简便且耗时短。此外,通过对发卡探针设计中适体序列部分的改变,该体系还可以拓展应用于其他目标物的检测,具有很强的通用性。

关键词：腺苷荧光适体传感器信号扩增定量检测

基于目标物诱导的结合作用构建荧光信号扩增生物传感平台用于检测汞离子和腺苷

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基于目标物诱导的结合作用构建荧光信号扩增生物传感平台用于检测...

作者：魏海平山东大学

学位级别：硕士

金属离子和小分子存在于诸多生命过程中,它们对于生命体的活动和健康具有重要影响。Hg2+是一种严重的环境污染物,具有高毒性和生物累积性,能够随食物链进入人体,损伤人类神经系统、肝脏、肾脏以及其他器官。腺苷是一种小分子药物,在治... 详细信息

金属离子和小分子存在于诸多生命过程中,它们对于生命体的活动和健康具有重要影响。Hg2+是一种严重的环境污染物,具有高毒性和生物累积性,能够随食物链进入人体,损伤人类神经系统、肝脏、肾脏以及其他器官。腺苷是一种小分子药物,在治疗心血管疾病中发挥重要作用,并且具有调节神经和免疫系统的功能,其表达水平与癌症的发生和发展阶段具有密切关系。因此,Hg2＋和腺苷的高选择性和高灵敏检测对于生命健康和疾病诊疗具有重要意义。功能性核酸能够选择性识别目标物或输出可检测信号,广泛应用于构建生物传感平台。核酸适体、DNAzymes和G-rich序列为常用的功能性核酸。其中,T-T错配碱基,作为Hg2+的核酸适体,与Hg2+结合,形成T-Hg2+-T金属碱基对,腺苷适体能够结合腺苷。核酸适体均可用于目标物的选择性结合。DNAzymes能够催化分子信标断裂,特定的G-rich序列形成的G-四倍体能够结合特定染料,均可用来获得扩增的可检测信号。在生物传感平台中,除了选择性结合目标物和输出可检测信号之外,还需要引入信号扩增来获得高灵敏度。鉴于以上分析,本文利用目标物诱导的结合作用构建荧光信号扩增生物传感平台用于选择性和灵敏检测Hg2+和腺苷。本文共分为三章：第一章为绪论,概述了金属离子和小分子的检测意义以及传统检测方法,介‘绍了功能性核酸在生物传感平台构建中的功能,以及常用的酶辅助的信号扩增策略,包括内切酶辅助的信号扩增策略、外切酶辅助的信号扩增策略、聚合酶辅助的信号扩增策略以及聚合/切刻酶辅助的信号扩增策略。第二章利用T-T错配碱基与Hg2＋选择性结合引发Exo Ⅲ辅助的目标物循环和DNAzyme循环为基础的荧光信号扩增构建生物传感平台用于检测Hg2+。本工作中,T-T错配碱基与Hg2＋的结合确保了目标物识别的高选择性,并且此结合作用能够引发Exo Ⅲ辅助的目标物循环和DNAzyme循环为基础的信号扩增,实现了对体系中Hg2＋的灵敏检测。本方法的线性范围为2.0×10-10 mol·L-1到1.0× 10-8mol·L-1,检测限低至7.2×10-11 mol·L-1,且具有良好的抵抗其他金属离子干扰的能力。此外,本方法能够实现自来水、河水和湖水中加标的Hg2＋以及污水中Hg2＋含量的测定。第三章利用目标物诱导的邻近结合构建免标记荧光信号扩增生物传感平台用于灵敏检测腺苷。本工作设计了含有两段分裂的腺苷适体和聚合／切刻模板的双功能探针用来选择性识别腺苷和进行链置换扩增。与分裂在两个探针中的腺苷适体相比,本探针的腺苷适体具有较高的局部浓度,更易与腺苷结合,获得高的结合效率。借助链置换扩增和滚环扩增,得到大量含有G-四倍体序列的产物,插入ThT染料得到免标记的荧光信号。本工作的线性范围为5.0×10-7 mol·L-1到2.0×10-5 mol·L-1,检测限低至8.4×10mol·L-1,达到人尿样中腺苷含量检测要求,具有检测实际样品的潜在应用价值。

关键词： Hg2+ 腺苷结合作用信号扩增荧光

基于DNA分子识别探针及信号扩增策略的博来霉素检测新方法研究

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基于DNA分子识别探针及信号扩增策略的博来霉素检测新方法研究

作者：王慧娟山东大学

学位级别：硕士

博来霉素,是一种重要的抗癌药物,疗效显著且具有低骨髓抑制和低免疫抑制的优势,被广泛应用于多种癌症的治疗,如鳞状细胞癌、生殖细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、子宫颈癌以及恶性淋巴瘤等。博来霉素的治疗窗较窄,且由于个体差异,相同剂量的药... 详细信息

博来霉素,是一种重要的抗癌药物,疗效显著且具有低骨髓抑制和低免疫抑制的优势,被广泛应用于多种癌症的治疗,如鳞状细胞癌、生殖细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、子宫颈癌以及恶性淋巴瘤等。博来霉素的治疗窗较窄,且由于个体差异,相同剂量的药物在不同的患者体内会表现出不同的血药浓度。因此,博来霉素血药浓度监测对于制定合理有效的临床给药方案、提高其抗癌疗效以及降低毒副作用具有重要意义。博来霉素具有选择性裂解DNA链的性质,因此利用特定DNA链作为反应底物识别博来霉素,可以建立基于DNA纳米技术的生物传感方法,用于博来霉素的灵敏、特异检测。相比于其他检测技术,基于DNA纳米技术的生物传感方法具有灵敏、特异、操作简单及可程序化设计的优势。本论文以DNA纳米技术为基础,设计并构建了新型的博来霉素DNA识别探针,结合酶介导的信号放大策略,建立了新型的生物传感分析方法,并将其用于博来霉素灵敏、特异、免标及快速检测。本论文第一章为绪论部分,对博来霉素的发现和临床应用、博来霉素裂解DNA链的机理及博来霉素检测方法进行了概述。并对生物传感技术中常用的DNA分子识别探针和酶介导的等温信号扩增策略进行了介绍。本论文第二章,设计并构建了一种新型的博来霉素识别探针——双环发夹探针,并利用该探针建立一种荧光生物传感器,实现了博来霉素的免标记、灵敏检测。双环发夹探针包含两个功能区域：博来霉素识别位点5’-GTGC-3’和DNA触发序列。首先,博来霉素能够特异性识别该探针,并将其切割,释放触发序列。过量的探针则能够通过DNA分子内杂交将DNA触发序列沉默,从而降低方法的背景。接着,触发序列触发循环的链取代扩增反应（SDA）,实现检测信号的放大,检测限达0.34 nM,线性范围为2 nM-220 nM,且首次实现了博来霉素的免标记检测。该方法能够准确区分博来霉素及其它抗肿瘤药物,具有良好的选择性。此外,方法的人血清回收率均在为95%-99%之间,说明该方法的准确性良好。但临床实验表明,在静脉注射给药方式下,人体内博来霉素血药浓度变化范围（24 h）为1.4nM-2.7μM,因此本方法的灵敏度仍不能满足临床血药浓度监测的需要。为了进一步提高博来霉素检测方法的灵敏度,本论文第三章利用双环发夹探针介导的级联信号扩增策略,建立了多重放大荧光传感体系,实现了博来霉素的高灵敏、免标记检测。该方法中,博来霉素识别并切割双环发夹探针,释放DNA触发序列。接着触发序列介导链取代扩增反应（SDA）和指数扩增反应（EXPAR）,实现信号的级联放大。本方法的检测达35 pM,线性范围为40 pM-10 nM,能够满足临床24 h内患者血药浓度监测对方法灵敏度的要求。该方法能够准确区分博来霉素及其它抗肿瘤药物,具有良好的选择性。同时方法在人血清中的回收率为95%-97%,说明本方法具有良好的准确性,能够用于实际样品中博来霉素的定量检测。

关键词：博来霉素 DNA分子识别探针信号扩增荧光传感器

核酸酶诱导杂交链式反应用于信号扩增及细胞成像

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核酸酶诱导杂交链式反应用于信号扩增及细胞成像

作者：龚珂珂武汉大学

学位级别：硕士

杂交链式反应(HCR)是一种传统的无蛋白酶参与的核酸恒温放大策略,具有经济成本低、反应条件温和以及扩增效率高等优点,在生物分析领域引起了广泛关注。脱氧核糖核酸酶(DNAzyme)是一种经体外筛选得到的具有催化性能的单链核酸。与蛋白酶... 详细信息

杂交链式反应(HCR)是一种传统的无蛋白酶参与的核酸恒温放大策略,具有经济成本低、反应条件温和以及扩增效率高等优点,在生物分析领域引起了广泛关注。脱氧核糖核酸酶(DNAzyme)是一种经体外筛选得到的具有催化性能的单链核酸。与蛋白酶相比,DNAzyme具有功能化灵活、化学性质稳定、经济有效以及非特异性吸附低等优势。实验室常用的DNAzyme可以循环催化裂解底物,使得DNAzyme放大技术在分析检测领域的应用得到迅速发展。在本论文中,我们将HCR核酸扩增与DNAzyme信号放大技术进行整合,发展了两种无蛋白酶参与的恒温核酸扩增方法,用于癌症标志物micro RNA的检测,为早期癌症的临床诊断开辟了新的思路。具体的研究工作如下:(1)通过整合HCR核酸扩增与DNAzyme信号放大,提出了一种无蛋白酶介导的、具有多重扩增效率的反馈型HCR-DNAzyme方法,用于核酸的体外检测以及细胞内成像。基本原理是:目标分析物诱导HCR发夹交互打开自组装得到高分子量的双链核酸纳米线,此核酸共聚物中包含有两种Mg依赖的DNAzyme结构,其中一个为信号传导模块,可以催化裂解修饰有荧光团/猝灭剂的底物,获得荧光输出信号;另外一个为核酸反馈模块,剪切双链底物并释放大量的目标核酸,用于引发新一轮HCR反应。我们的信号转导模块可以进一步替换为G-四链体DNAzyme结构,进而发展出一种无需标记的比色方法,用于核酸检测。此外,通过引入辅助传感模块可以将本体系扩展为一个通用的检测方法,用于细胞内癌症标志物(如micro RNA)的检测。该扩增体系能够用于活细胞内源性miR-21致癌基因的原位扩增检测。(2)基于DNAzyme调控杂交链式反应,我们发展了一个非蛋白酶扩增体系,用于miR-21高效荧光分析。原理是:借助DNAzyme对HCR发夹反应物H(环部标记有Cy3荧光基团)进行预封闭,Zn激活DNAzyme,剪切得到带有黏性末端的发夹H,目标物miR-21引发发夹H(5’端修饰有Cy5荧光基团)和发夹H相互杂交,得到含有大量Cy3和Cy5相互靠近的双链核酸纳米线,产生FRET荧光信号,用于体外miRNA分析。该DNAzyme调控HCR反应的策略有望用于细胞内miRNA的原位监测及成像。

关键词：杂交链反应脱氧核糖核酸酶信号扩增癌症标志物

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原位杂交组织化学技术中信号扩增的研究进展

动物医学进展 2006年第1期27卷 21-24页

作者：肖一红孟庆文吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

原位杂交组织化学(ISHH)技术是利用两条互补单链之间通过核酸分子碱基的氢键配对反应形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学方法,在核酸原有的位置上把它显示出来。目前它已是一种比较成熟的技术,因其能对核酸进行... 详细信息

原位杂交组织化学(ISHH)技术是利用两条互补单链之间通过核酸分子碱基的氢键配对反应形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学方法,在核酸原有的位置上把它显示出来。目前它已是一种比较成熟的技术,因其能对核酸进行原位检测而得到广泛的应用。ISHH的种类很多,其方法的改进主要在于检测信号提高上目前用于信号扩增的方法主要有原位PCR侧链系统、酪胺信号放大、催化报告分子沉淀、尾探针原位杂交和原位引物延伸标记这些方法的建立,不同程度的提高了信噪比使ISSH的灵敏性增加并得到广泛的应用。

关键词：原位杂交组织化学原位PCR 信号扩增

基于ATP适配体片段重新结合的信号扩增电致化学发光生物传感器的设计

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基于ATP适配体片段重新结合的信号扩增电致化学发光生物传感器的...

基于纳米复合材料构建电化学适配体传感器检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇研究

第十一届全国电分析化学会议

作者：罗芳林振宇邱彬陈国南食品安全分析与检测教育部重点实验室福建食品安全分析与检测重点实验室福州大学化学系

＜正＞电致化学发光是在化学发光的基础上发展起来的一种分析方法,它结合了化学发光与电化学的优点,具有灵敏高、选择好、易于实现连续自动分析等特点[1]。ATP是生物体内的重要能源物质,是体内能量代谢和转换的中心。因此对ATP的检测不... 详细信息

＜正＞电致化学发光是在化学发光的基础上发展起来的一种分析方法,它结合了化学发光与电化学的优点,具有灵敏高、选择好、易于实现连续自动分析等特点[1]。ATP是生物体内的重要能源物质,是体内能量代谢和转换的中心。因此对ATP的检测不仅具有一定的研究意义还有重要的临床应用价值。为了实现对ATP的高灵敏检测,我们设计并实现了一种基于ATP

关键词：电致化学发光 ATP适配体信号扩增生物传感器

来源： cnki会议评论

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基于纳米复合材料构建电化学适配体传感器检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇...

作者：王楷河南工业大学

学位级别：硕士

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又称为呕吐毒素,主要由镰刀菌产生,广泛存在于玉米、小麦、大麦、黑麦等谷物中,是谷物中最常见的污染物之一。DON具有细胞毒性、免疫毒性、生殖毒性等,与其他毒素共存会产生协同效应。DON化学... 详细信息

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又称为呕吐毒素,主要由镰刀菌产生,广泛存在于玉米、小麦、大麦、黑麦等谷物中,是谷物中最常见的污染物之一。DON具有细胞毒性、免疫毒性、生殖毒性等,与其他毒素共存会产生协同效应。DON化学性质稳定,在谷物加工过程中很难去除,人类可以通过摄入受污染的食物直接接触DON,也可能通过呼吸道、皮肤和粘膜接触而暴露于DON。因此,建立DON的检测方法具有重要的现实意义。电化学分析技术具有操作简单、响应速度快等优点。本研究以核酸适配体为生物识别元件,结合复合纳米材料的信号放大策略构建电化学生物传感器用于检测DON。1.首先,以核酸适配体(Apt)代替传统的抗体作为生物识别元件,采用溶剂热法制备铁酸镍纳米管(Ni FeO NTs)作为基底材料,电沉积金后的修饰电极(Dp Au/Ni FeO NTs/Au E)作为传感平台,金铂核壳纳米棒(Au@Pt NRs)作为负载信号分子硫堇(Thi)和互补链(c DNA)的载体,引入竞争策略,构建了用于检测DON的“信号关闭”型适配体传感器。研究中,对Ni FeO NTs体积、电沉积金时间、Apt浓度、Thi与Au@Pt NRs-c DNA的比例、DON孵育时间分别进行了优化。结果表明,在最优实验条件下,设计的适配体传感器对DON的检测线性范围为1×10～5×10 mg·m L,检测限为3.02×10 mg·m L。对玉米粉中进行回收率测试,回收率为98.40%～103.5%,所构建的电化学核酸适配体传感器可以用于DON的检测。2.针对基底材料物理吸附易脱落的问题,引入核酸外切酶III(Exo III)辅助的三重循环信号扩增策略提高靶标的利用率。研究中,利用聚乙烯亚胺功能化还原氧化石墨烯复合铂钯纳米颗粒(Pt Pd NPs/PEI-r GO)通过共价键合固定在电极上,增加了电极的表面积,同时提高了电极的电导率。DON和Apt的特异性结合触发了Exo III的循环扩增,产生了触发器(Tr)(循环I),Tr和锁定探针(LP)的杂交激活DNA步行机(DNA walker)(循环II),DNA walker在Exo III的作用下导致电信号响应降低(循环III),该策略将一个结合事件转化为多个信号输出,大大提高了靶标利用率,实现了响应信号的有效扩增。在最优实验条件下,所构建的电化学适配体传感器线性响应范围为1×10 mg·m L～1×10 mg·m L,检出限为6.9×10 mg·m L,加标回收率为95.80%～101.5%,结果令人满意。3.基于Exo III的信号放大策略一定程度上实现了响应信号的有效放大,但信号减小型适配体传感器的检测灵敏度和检出限容易受到空白电流的限制,为进一步提高传感器的检测性能,简化操作步骤,构建了信号增大型无标记电化学适配体传感器,同时引入磁分离技术降低基质干扰。铈基金属有机骨架复合金纳米粒子(Ce MOF@Au)修饰电极有效提高了电极的电子转移速率,同时为适配体提供更多的活性位点。结果表明,在最优实验条件下,信号分子[Fe(CN)]的响应信号与DON浓度在1×10 mg·m L～5×10 mg·m L浓度范围内呈现良好的线性关系,检出限为1.79×10 mg·m L,加标回收率为94.38%～98.68%,为电化学适配体传感器检测DON提供了新思路。

关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适配体电化学复合纳米材料信号扩增

基于无酶串联DNA电路的生物分子检测与成像

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基于无酶串联DNA电路的生物分子检测与成像

作者：谢玲玲武汉科技大学

学位级别：硕士

背景:生物分子是自然存在于生物体中的分子的总称,是组成生命的基本单位。对关键生物分子进行活体原位成像,有利于实现其生物功能解析及新型诊疗试剂的开发。近年来,虽然核酸适配体传感器在分子检测领域取得了较大的进展,但其在高灵敏... 详细信息

背景:生物分子是自然存在于生物体中的分子的总称,是组成生命的基本单位。对关键生物分子进行活体原位成像,有利于实现其生物功能解析及新型诊疗试剂的开发。近年来,虽然核酸适配体传感器在分子检测领域取得了较大的进展,但其在高灵敏、高准确性活体分子成像方面仍然受限。核酸串联扩增分析是指以核酸分子作为元件构建功能模块的一类新兴的传感分析技术,一般由靶标捕获识别和信号串联扩增输出的两个功能模块组成。将不同的核酸扩增线路进行串联,可形成DNA电路。DNA催化电路具有设计简单、稳定性好、高度可编程性等优点,可灵活串联,在等温条件下对单个分析物进行多重转换输出放大信号,为胞内分子原位放大检测提供了有效手段,在生物分子成像领域展现出巨大的应用潜力。目的:构建具有高灵敏性、高特异性和普适性的适配体传感器用于活体内生物活性分子的检测与成像。方法:利用DNA催化电路高度可编程性等优点和核酸适配体对配体的高特异性和亲和性的特点,构建基于无酶串联DNA电路的适配体传感器用于生物分子检测与成像。首先,通过凝胶电泳实验、原子力显微镜成像和荧光实验验证该适配体传感器的可行性;其次,对该适配体传感器进行条件优化使其具有最佳的传感性能;接着,以三磷酸腺苷(ATP)为靶标分子,探究该适配体传感器对ATP体外检测的灵敏性,同时引入ATP的类似物,探究该适配体传感器对ATP的检测特异性;另外,将该适配体传感器进行简单的修改和设计用于检测其他生物分子(例如:凝血酶和细胞色素C),研究其普适性;然后,使用转染试剂将该适配体传感器转入He La细胞中,探究其用于胞内ATP成像的效果;最后,将该适配体传感器封装在肿瘤靶向性纳米载体中,探究其在活体肿瘤内对ATP成像与定位的效果。结果:(1)该适配体传感器是切实可行的,可以在体外灵敏地检测ATP,最低检测限是106 n M;(2)与ATP类似物相比,该适配体传感器对ATP具有明显的响应性,可以很容易的将ATP与其他相似的生物分子区分开来,特异性地识别并结合ATP分子;(3)重新设计修改后的适配体传感器对凝血酶的检测限可低至5 p M,对细胞色素C的最低检测限为0.1μM,表明该适配体传感器可以作为一个通用的检测平台用于其他生物分子的检测;(4)共聚焦成像以及相应的荧光信号散点图和统计直方图结果显示该适配体传感器在活细胞内对ATP优秀的检测性能;(5)活体成像结果以及小鼠肿瘤部位荧光信号的定量分析图显示该适配体传感器能够以高空间选择性实现肿瘤靶向ATP分子成像。结论:本文成功构建了具有高灵敏性、高特异性和普适性的适配体传感器,通过肿瘤靶向载体递送,该适配体传感器实现了活体肿瘤内ATP分子的高灵敏成像与精准定位,在其他关键生物分子的原位可视化与相关生理过程研究领域具有巨大应用潜力。

关键词：适配体传感器核酸电路信号扩增三磷酸腺苷凝血酶