检索结果-南通市图书馆

遗传 2024年第6期46卷 466-477页

作者：马宝霞杨森吕明王昱人常立业韩艺帆王建刚郭杨徐坤西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100 新疆维吾尔自治区畜牧总站乌鲁木齐830002

在哺乳动物细胞中进行基因敲入通常采用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)机制将外源DNA模板整合到目标基因组靶点中。然而HDR效率往往较低,其中外源DNA模板与目标基因组靶点的共定位是关键限制因素之一。为提高CRISPR/Cas9... 详细信息

在哺乳动物细胞中进行基因敲入通常采用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)机制将外源DNA模板整合到目标基因组靶点中。然而HDR效率往往较低,其中外源DNA模板与目标基因组靶点的共定位是关键限制因素之一。为提高CRISPR/Cas9系统介导的HDR效率,本团队及前人研究将不同接头蛋白与SpCas9蛋白融合表达,利用其与特异性DNA序列结合的特性,构建了多种CRISPR/SpCas9供体适配基因编辑系统。为了便于比较、优化不同CRISPR/Cas9供体适配系统,本研究利用这些系统在HEK293T细胞GAPDH和ACTB基因末位外显子3′-端进行了eGFP基因敲入,并采用了优化的供体DNA模板设计方式,通过PCR和Sanger测序检测敲入的准确性,流式细胞分析进行敲入效率的检测。结果表明,将yGal4BD、hGal4BD、hLacI、hTHAP11和N57等接头蛋白与SpCas9蛋白C-端融合对其活性均无显著性影响;在GAPDH位点上,SpCas9融合yGal4BD、hGal4BD、hLacI和hTHAP11的供体适配系统等均能显著提高敲入效率;在ACTB位点上,SpCas9融合yGal4BD和hGal4BD能显著提高敲入效率;且增加供体DNA模板中的结合序列(binding sequence,BS)数量,有利于提高SpCas9-hTHAP11系统介导的敲入效率。总之,本研究比较并优化了不同的CRISPR/Cas9供体适配基因编辑系统,为后续相关的基因编辑应用研究提供了参考和借鉴。

关键词：基因编辑基因敲入 CRISPR/Cas9 供体适配同源定向修复

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一种新型提高HDR效率的 CRISPR/Cas9-Gal4BD 供体适配基因编辑系统

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遗传 2022年第8期44卷 708-719页

作者：张潇筠徐坤沈俊岑穆璐钱泓润崔婕妤马宝霞陈知龙张智英魏泽辉西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100

近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的... 详细信息

近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略,但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略,并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donor adapting system,DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain,Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达,将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence,Gal4BS)作为受体序列与双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体结合,以期提高HDR效率。使用***报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100~60 bp)时该系统能够提高HDR效率2~4倍。进一步的优化研究表明,融合端口和融合使用连接子(linker)的选择会影响Cas9表达效果及活性,而GGS5作为Cas9-Gal4BD融合的连接子则影响较小。同时,本研究还发现Gal4BS-dsDNA供体的差异化设计也会影响HDR效率,将Gal4BS添加到dsDNA供体5′-端的效果最佳。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在AAVS1和EMX1位点上实现了HDR编辑效率的提高,为进一步利用该系统进行动物分子设计育种研究提供了参考和借鉴。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑供体DNA 供体适配同源指导修复

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一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

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生物工程学报 2023年第10期39卷 4204-4218页

作者：马宝霞崔婕妤钱泓润张潇筠杨森张骐镜韩艺帆张智英王建刚徐坤西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高... 详细信息

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的SpCas9和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统(donor adapting system,DAS)。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复(homology-directed repair,HDR)效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacIDAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。

关键词：基因编辑 CRISPR/Cas9 LacI基因 LacO序列供体适配

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Gal4BD-SlugCas9/AsCas12a供体适配基因编辑系统研究

Gal4BD-SlugCas9/AsCas12a供体适配基因编辑系统研究

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作者：钱泓润西北农林科技大学

学位级别：硕士

在哺乳动物细胞中,DNA双链断裂(double strand break,DSB)主要通过同源指导修复(homology-directed repair,HDR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)两种机制进行修复。其中,HDR借助于外源供体DNA模板的重组效应能够在目标基因组位点实现精准的点编辑和基因敲入。但是,由于HDR效率远远低于NHEJ,使得HDR基因编辑策略在动物分子设计育种研究中的应用受到了极大的限制。鉴于在采用HDR策略进行基因编辑时外源供体DNA能否在DSB处有效募集是其中的一个关键问题,实验室提出了增强HDR基因编辑效果的供体适配系统(donor adapting system,DAS)的概念,并开发了CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS。该系统将酵母源的Gal4 DNA结合域(binding domain,BD)与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的Sp Cas9融合表达,将Gal4蛋白结合序列(binding sequence,BS)与双链DNA(double-stranded DNA,ds DNA)结合,籍此实现BS-ds DNA供体向DSB处募集,以提高HDR基因编辑的效率。由于Sp Cas9蛋白较大,与Gal4BD融合不利于蛋白表达、病毒包装及活体递送等过程,本研究采用了两种小型化Cas蛋白—路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的Slug Cas9变体Slug Cas9-HF与氨基酸球菌(Acidaminococcus)源的As Cas12a,进一步开发了新型的CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9和CRISPR/Gal4BD-As Cas12a供体适配基因编辑系统。首先在报告载体水平对两套供体适配系统进行了Cas蛋白活性、系统功能验证及初步优化;进而在基因组水平进行了HDR基因编辑效率验证。主要研究内容及结果如下:1.采用重组DNA技术先后构建了p CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9、p CRISPR/Slug Cas9-Gal4BD、p CRISPR/Gal4BD-As Cas12a和p CRISPR/As Cas12a-Gal4BD等DAS核心载体骨架4个、打靶载体6个、单链拟合(single strand annealing,SSA)活性报告载体1个、HDR效率报告载体1个、HDR-USR报告富集载体2个及ds DNA供体模版载体1个。2.通过SSA活性报告试验检测Cas蛋白活性,初步证明了Gal4BD与Slug Cas9、As Cas12a N-端融合对其活性影响较小。3.通过HDR效率报告试验验证两套供体适配系统的功能,同时优化供体设计方案,结果表明:对于CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9 DAS,BS融合在ds DNA供体3’-端(ds DNA-BS)效果较好;对于CRISPR/Gal4BD-As Cas12a DAS,则推荐BS融合在ds DNA供体5’-端(BS-ds DNA)。4.利用CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9 DAS对HEK293T细胞中VEGFA位点实现了高达35%的精确编辑,效率显著高于对照组。总之,本研究开发了旨在提高HDR效率的CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9和CRISPR/Gal4BD-As Cas12a供体适配基因编辑系统并进行了初步的优化和验证,为进一步的动物基因编辑及畜禽分子设计育种研究提供了新的技术手段。

关键词：供体适配基因编辑同源指导修复 SlugCas9 AsCas12a Gal4BD

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CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统研究

CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统研究

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作者：张潇筠西北农林科技大学

学位级别：硕士

CRISPR基因编辑工具的衍生技术迅速在生命科学、生物医学以及动植物育种领域得到应用。基于基因编辑技术的新兴分子设计育种可以达到快速改良动物在育种的目的。同源重组修复(homology-directed repair,HDR)是基因敲入和精确编辑的重要... 详细信息

CRISPR基因编辑工具的衍生技术迅速在生命科学、生物医学以及动植物育种领域得到应用。基于基因编辑技术的新兴分子设计育种可以达到快速改良动物在育种的目的。同源重组修复(homology-directed repair,HDR)是基因敲入和精确编辑的重要策略,但是其编辑效率仍然有待提高。基于将供体DNA驱动富集至双链断裂处(double-stranded break,DSB)的思路,已有几套CRISPR/Cas9衍生系统被报道用于提高HD R的基因编辑效率。本文使用供体适配系统(Donor Adapting System,DAS)一词来概括那些用适配子修饰CRISPR/Cas9系统以达到驱动与适配接头融合连接的供体DNA的基因编辑策略。同时设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配系统,将酵母Gal4蛋白中的DNA结合域与Cas9蛋白进行融合表达,利用PCR设计在双链DNA供体上添加与其特异性结合的序列(Binding Sequence,BS),使其能够与Cas9-Gal4BD融合蛋白进行结合同时在DBS处募集达到较高的有效浓度,从而提高HDR效率的一套编辑系统。并对CRISPR/Cas9-Gal4BD系统的融合设计和供体进行优化验证,并使用优化后的系统在基因组上进行精确编辑。本研究的主要结果如下:1.使用重组DNA技术构建了CRISPR/Cas9-GGS1-Gal4BD、CRISPR/Cas9-GGS3-Gal4BD、CRISPR/Cas9-GGS5-Gal4BD等主要表达载体及其相关报告载体。2.将酵母转录因子Gal4的DNA结合域(Gal4 BD)和能够特异性的识别并结合的特异性结合序列(Binding Sequence,BS)引入CIRSPR/Cas9系统及双链DNA(ds DNA)供体。构建CIRSPR/Cas9-Gal4BD供体适配系统。3.通过SSA活性报告试验对CIRSPR/Cas9-Gal4BD融合方式进行优化设计试验,获得以GGS5(5个重复GGS序列)作为连接linker同时Gal4BD蛋白融合在Cas9蛋白C端的融合对Cas9蛋白活性和表达影响最小。4.通过HDR效率报告试验进一步对BS-ds DNA供体进行优化设计试验,发现单个BS序列添加在PCR双链供体的5’端的BS-ds DNA供体设计方案的HDR效率比其他设计高出20～60%。5.使用优化后的Cas9-Gal4BD融合表达方案和BS-ds DNA供体设计方案对HEK293T细胞基因组进行精确编辑。在选择的四个基因位点(AAVS1,***5,VEGFA)上进行编辑后的结果显示,有三个基因位点的HDR编辑的效率提高了20%同时发现本系统对CRISPR/Cas9系统的脱靶效应具有抑制作用。

关键词： CRISPR/Cas9系统 HDR Cas9-Gal4BD融合表达供体适配双链DNA供体

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