不同CRISPR/Cas9供体适配基因编辑系统的比较及优化研究

作     者：马宝霞 杨森 吕明 王昱人 常立业 韩艺帆 王建刚 郭杨 徐坤 Baoxia Ma;Sen Yang;Ming Lyu;Yuren Wang;Liye Chang;Yifan Han;Jiangang Wang;Yang Guo;Kun Xu

作者机构：西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100 新疆维吾尔自治区畜牧总站乌鲁木齐830002 

出 版 物：《遗传》 (Hereditas（Beijing))

年 卷 期：2024年第46卷第6期

页      面：466-477页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：科技创新2030−农业生物育种重大项目(编号:2023ZD04074 2023ZD04051)资助 

主　　题：基因编辑 基因敲入 CRISPR/Cas9 供体适配 同源定向修复 

摘      要：在哺乳动物细胞中进行基因敲入通常采用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)机制将外源DNA模板整合到目标基因组靶点中。然而HDR效率往往较低,其中外源DNA模板与目标基因组靶点的共定位是关键限制因素之一。为提高CRISPR/Cas9系统介导的HDR效率,本团队及前人研究将不同接头蛋白与SpCas9蛋白融合表达,利用其与特异性DNA序列结合的特性,构建了多种CRISPR/SpCas9供体适配基因编辑系统。为了便于比较、优化不同CRISPR/Cas9供体适配系统,本研究利用这些系统在HEK293T细胞GAPDH和ACTB基因末位外显子3′-端进行了eGFP基因敲入,并采用了优化的供体DNA模板设计方式,通过PCR和Sanger测序检测敲入的准确性,流式细胞分析进行敲入效率的检测。结果表明,将yGal4BD、hGal4BD、hLacI、hTHAP11和N57等接头蛋白与SpCas9蛋白C-端融合对其活性均无显著性影响;在GAPDH位点上,SpCas9融合yGal4BD、hGal4BD、hLacI和hTHAP11的供体适配系统等均能显著提高敲入效率;在ACTB位点上,SpCas9融合yGal4BD和hGal4BD能显著提高敲入效率;且增加供体DNA模板中的结合序列(binding sequence,BS)数量,有利于提高SpCas9-hTHAP11系统介导的敲入效率。总之,本研究比较并优化了不同的CRISPR/Cas9供体适配基因编辑系统,为后续相关的基因编辑应用研究提供了参考和借鉴。