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哺乳动物体细胞核移植胚胎发育中表观重编程的研究进展

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中国畜牧兽医 2022年第6期49卷 2259-2269页

作者：闫业联张梦雅刘秋晨汪薪徐长志宗艳峰朱治桦吴苏城宋雨李运生张运海曹祖兵安徽农业大学动物科学技术学院地方畜禽遗传资源保护与生物育种安徽省重点实验室合肥230036

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是一种能将已分化的体细胞重编程为全能胚胎的繁殖生物技术,在良种扩繁、濒危物种保护和治疗性克隆等方面有着广泛的应用前景,但极低的克隆效率、克隆动物胎盘异常、出生后胎儿畸形等... 详细信息

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是一种能将已分化的体细胞重编程为全能胚胎的繁殖生物技术,在良种扩繁、濒危物种保护和治疗性克隆等方面有着广泛的应用前景,但极低的克隆效率、克隆动物胎盘异常、出生后胎儿畸形等严重限制了该技术的实际应用。造成克隆效率低和胚胎发育异常的主要原因是供体核表观遗传重编程错误或不完全。1958年,将非洲爪蟾(Xenopus laevis)幼体肠细胞核移入去核卵母细胞,获得了第1例SCNT动物个体;1986年,通过电融合1个卵裂球与去核卵母细胞成功获得了3只存活的羔羊;1997年,将成年母羊的乳腺上皮细胞与去核卵细胞电融合,获得首个SCNT哺乳动物“多利”,开启了克隆时代,目前牛、小鼠、山羊、猪、欧洲盘羊、家兔、家猫、马、大鼠、骡子、狗、雪貂、狼、水牛、红鹿、单峰骆驼、食蟹猴等相继成功克隆,其中最引人瞩目的是2018年食蟹猴的成功克隆。作者通过将SCNT胚胎与受精胚胎的发育进行对比,阐述了SCNT过程中DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹、染色体状态等的重编程过程和缺陷,并从表观修饰剂、组蛋白去甲基化酶、抑制Xist表达、补充鱼精蛋白和精子RNA方面探讨单独或联合消除表观遗传重编程障碍对克隆效率的影响。随着低样本量测序技术的发展和完善,人们能够在SCNT胚胎中检测到更详细的全基因组表观遗传修饰图谱,进一步揭示SCNT胚胎表观遗传重编程中的缺陷,为提高克隆效率提供了线索。通过上述内容的阐述,希望为后续开发联合消除多种表观遗传障碍而提高克隆效率的策略和思路。

关键词：体细胞核移植表观遗传重编程克隆效率

体细胞核移植后表观遗传重编程的异常及其修复

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遗传 2014年第12期36卷 1211-1218页

作者：纪慧丽卢晟盛潘登科广西大学动物科学技术学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室北京100193

体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)是指将高度分化的体细胞移入到去核的卵母细胞中发育并最终产生后代的技术。然而,体细胞克隆的总体效率仍然处于一个较低的水平,主要原因之一是由于体细胞供体核不完全的表观遗传重编... 详细信息

体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)是指将高度分化的体细胞移入到去核的卵母细胞中发育并最终产生后代的技术。然而,体细胞克隆的总体效率仍然处于一个较低的水平,主要原因之一是由于体细胞供体核不完全的表观遗传重编程,包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、基因组印记、X染色体失活和端粒长度等修饰出现的异常。使用一些小分子化合物以及Xist基因的敲除或敲低等方法能修复表观遗传修饰错误,辅助供体核的重编程,从而提高体细胞克隆效率,使其更好地应用于基础研究和生产实践。文章对体细胞核移植后胚胎发育过程中出现的异常表观遗传修饰进行了综述,并着重论述了近年来有关修复表观遗传错误的研究进展。

关键词：体细胞核移植重编程表观遗传异常小分子化合物

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体细胞核移植胚胎核重编程的研究进展

Acta Genetica Sinica 2004年第6期31卷 641-646页

作者：杨正田沈伟邓继先军事医学科学院生物工程研究所北京100071

尽管在多种哺乳动物种系中成功制备了体细胞克隆后代 ,但当前的克隆技术仍有许多亟待解决的问题。体细胞核移植胚胎大多存在许多发育异常 ,造成了妊娠早期高流产率和出生后高死亡率。有研究认为 ,克隆胚胎发育障碍的一个重要的原因是供... 详细信息

尽管在多种哺乳动物种系中成功制备了体细胞克隆后代 ,但当前的克隆技术仍有许多亟待解决的问题。体细胞核移植胚胎大多存在许多发育异常 ,造成了妊娠早期高流产率和出生后高死亡率。有研究认为 ,克隆胚胎发育障碍的一个重要的原因是供体细胞的遗传重编程不完全。哺乳动物种系中 ,DNA甲基化是胚胎发育期转录调节的必需步骤 ,除了单拷贝基因序列外 ,在基因组很多的区域都可以观测到克隆胚胎的异常甲基化。此外 ,克隆胚胎的基因印迹也存在异常。

关键词：体细胞核移植重编程印迹甲基化

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体细胞核移植与中心体遗传

遗传 2008年第8期30卷 960-966页

作者：杜卫华朱化彬郝海生王栋中国农业科学院北京畜牧兽医研究所胚胎工程与繁殖技术研究室北京100094

体细胞克隆虽然在多种哺乳动物中成功获得后代,但仍存在一系列的问题需要解决。克隆胚胎的发育能力由核移植后几小时内的细胞和分子过程决定,包括染色体分离和纺锤体的重新组装。中心体的正常组成和分布能保证染色体分离的准确性及新生... 详细信息

体细胞克隆虽然在多种哺乳动物中成功获得后代,但仍存在一系列的问题需要解决。克隆胚胎的发育能力由核移植后几小时内的细胞和分子过程决定,包括染色体分离和纺锤体的重新组装。中心体的正常组成和分布能保证染色体分离的准确性及新生和出生后克隆动物发育过程中的基因组稳定性。文章在分析哺乳动物体细胞克隆存在的问题和简介中心体结构功能的基础上,综述了中心体在配子和受精卵发育过程中的遗传机制,同时阐述了体细胞克隆胚胎中心体及其相关蛋白的研究现状。

关键词：体细胞核移植胚胎发育中心体

调控BRG1表达对猪体细胞核移植胚胎发育影响的初步研究

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调控BRG1表达对猪体细胞核移植胚胎发育影响的初步研究

作者：仝毅广西大学

学位级别：硕士

BRG1是染色质重塑复合物SWI/SNF家族的核心催化亚基,具有解旋酶和ATP酶活性,在开放染色质、改变局部核小体定位和调控哺乳动物细胞基因转录(激活或抑制)以及体细胞重编程等方面起着至关重要的作用。目前对BRG1在体细胞核移植方面的作用... 详细信息

BRG1是染色质重塑复合物SWI/SNF家族的核心催化亚基,具有解旋酶和ATP酶活性,在开放染色质、改变局部核小体定位和调控哺乳动物细胞基因转录(激活或抑制)以及体细胞重编程等方面起着至关重要的作用。目前对BRG1在体细胞核移植方面的作用研究尚为空白,为此,本试验以猪胎儿成纤维细胞为供体细胞,首先分析调控BRG1表达对供体细胞表观修饰相关基因表达及染色质开放程度的影响;随后进行体细胞核移植,探究供体细胞过表达BRG1对猪核移植胚胎发育的影响。研究结果为阐明BRG1对供体细胞表观遗传修饰状态的调控作用,进一步改善猪体细胞核移植效率奠定了基础。试验结果如下:一、调控BRG1表达对猪胎儿成纤维细胞表观修饰水平及染色质开放程度的影响1.采用免疫荧光和q RT-PCR方法分析表观遗传修饰相关基因的表达情况。免疫荧光结果显示,在血清饥饿处理组中,过表达BRG1后5-mC、H3K14ac表达水平升高,H3K9me3表达水平降低。q RT-PCR结果显示,过表达BRG1使DNMT1、HAT1的表达显著升高(P体细胞过表达BRG1对染色质开放程度和基因转录水平的影响。首先利用免疫荧光方法检测HP1α的表达水平,然后进行ATAC-seq和RNA-seq分析。免疫荧光结果显示,过表达BRG1会降低胎儿成纤维细胞HP1α的表达水平。ATAC-seq结果分析发现,过表达BRG1促使SMARCA4、NANOG、SOX2、MAP2K6、HIF1A基因的开放程度更高。RNA-seq结果显示,过表达BRG1与神经元的产生、发育以及自噬方面基因的相关性较高,并且差异上调基因富集在PI3K-AKT等信号通路。二、调控供体细胞BRG1表达对猪体细胞核移植胚胎发育的影响首先分析BRG1在体外成熟猪卵母细胞、孤雌激活和体细胞核移植早期胚胎中的表达模式,并探讨在供体细胞中过表达BRG1基因对猪核移植早期胚胎发育及相关基因表达的影响。q RT-PCR和免疫荧光结果显示,BRG1在体外成熟猪卵母细胞及孤雌激活胚胎的各个时期均有表达,在核移植胚胎中,与阴性对照组相比,BRG1在试验组的2-细胞和4-细胞时期表达显著升高(P核移植胚胎的囊胚率(17.83%vs 27.33%,P体细胞中上调BRG1基因表达可提高猪体细胞核移植胚胎早期发育能力。

关键词： BRG1基因猪胎儿成纤维细胞体细胞核移植染色质开放性体细胞重编程

体细胞核移植克隆民猪:培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

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中国科学（C辑） 2007年第6期37卷 634-640页

作者：刘忠华田江天郑重王振坤宋军尹智高力马海鹍孔庆然孙爽李玉田王洪斌东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030 哈尔滨市三元畜牧实业有限公司哈尔滨150030

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源,卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切.为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量,进而提高体细胞核移植猪的成功率,本实验以改进的TCM199培养液为基础液(... 详细信息

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源,卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切.为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量,进而提高体细胞核移植猪的成功率,本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T),分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养,以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准,研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响.T,T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%,(69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%,添加10%的pFF和FBS显著(P细胞成熟率;3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著,但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P细胞数(26.6±1.25).来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管,其中有3头受体母猪妊娠发育到期,获得克隆民猪14头,其中有6头健康成活至今.实验结果表明,培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量,在含有10%pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.

关键词：体细胞核移植体外成熟胎牛血清猪卵泡液猪

体细胞核移植技术在不同物种中的应用及提高其成功率的可能措施

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中国生物工程杂志 2008年第11期28卷 97-103页

作者：马利兵张涌潘建刚王凤梅华松曹俊伟内蒙古科技大学生物与化学工程学院包头014010 西北农林科技大学生物工程研究所杨凌712100 包头农牧学校包头014030 内蒙古农业大学生物工程学院呼和浩特010018

体细胞核移植技术具有极其广阔的应用前景,但极低的成功率限制了这项技术在实践生产中的应用。不同的学者在不同的物种上进行了一系列的尝试,试图提高体细胞核移植的成功率。就体细胞核移植技术在不同物种中的成功应用进行阐述,并就如... 详细信息

体细胞核移植技术具有极其广阔的应用前景,但极低的成功率限制了这项技术在实践生产中的应用。不同的学者在不同的物种上进行了一系列的尝试,试图提高体细胞核移植的成功率。就体细胞核移植技术在不同物种中的成功应用进行阐述,并就如何提高体细胞核移植成功率阐明一些观点。

关键词：体细胞核移植核供体核受体核移植程序

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)的猪胚胎

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畜牧兽医学报 2009年第5期40卷 633-638页

作者：冯冲周艳荣龙川刘晓陈红星潘登科杨博辉甘肃农业大学动物科学技术学院兰州730070 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与利用重点实验室北京100193 军事医学科学院生物工程研究所北京100071 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所兰州730050

本研究通过脂质体介导的方法将来源于线虫***的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)转染至大白猪胎儿成纤维细胞。采用600μ***-1G418药物浓度,经连续10 d筛选及PCR、RT-PCR鉴定,获得11个转基因阳性细胞克隆。以体外成熟42 h的猪卵母细胞与... 详细信息

本研究通过脂质体介导的方法将来源于线虫***的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)转染至大白猪胎儿成纤维细胞。采用600μ***-1G418药物浓度,经连续10 d筛选及PCR、RT-PCR鉴定,获得11个转基因阳性细胞克隆。以体外成熟42 h的猪卵母细胞与转基因细胞构建重构胚。经体外培养后观察,转基因克隆胚胎与非转基因胚胎的卵裂率(76.6%±4.1%vs.81.6%±3.1%)和囊胚率(10%±1.97%vs.9.7%±1.4%)均无显著差异(P>0.05)。采用放线菌酮进行化学二次激活时,胚胎的囊胚率显著高于采用电二次激活胚胎(20.6%±0.89%vs.10%±1.97%,P0.05)。研究表明,通过脂质体介导的方法,可以获得转sFat-1基因大白猪胎儿成纤维细胞系;以该细胞系为核供体构建的转基因克隆胚胎与非转基因克隆胚胎的发育能力无显著差异;二次激活采用放线菌酮进行化学激活能够显著提高胚胎的囊胚发育率。

关键词：猪 sFat-1基因胎儿成纤维细胞体细胞核移植

GTL2基因在体细胞核移植牛中的印记状态分析

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生物化学与生物物理进展 2008年第10期35卷 1183-1187页

作者：王建春李冬杰杜卫华樊宝良李宁李世杰河北农业大学生命科学学院保定071001 河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018 中国农科院北京畜牧兽医研究所北京100094 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京100094

体细胞核移植技术(SCNT)在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素.印记基因在哺乳动物胚胎发育和出生后的正常生长中都具有十分重要的作用,GTL2基因是在人和鼠中已被鉴定的印... 详细信息

体细胞核移植技术(SCNT)在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素.印记基因在哺乳动物胚胎发育和出生后的正常生长中都具有十分重要的作用,GTL2基因是在人和鼠中已被鉴定的印记基因,它作为一种RNA调解分子调控目的mRNA的转录.为了研究GTL2基因在自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的印记状态,首先应用PCR-SSCP方法对GTL2基因多态性进行检测,鉴定自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的杂合子,进而利用RT-PCR-SSCP技术对GTL2基因在杂合子牛的心、肝、脾、肺、肾、大脑中的表达状态进行分析.研究结果表明:GTL2基因在自然繁殖牛的被检测的6个组织中均表现为单等位基因表达,在体细胞核移植牛的心和肝中表现为单等位基因表达,而在大脑、脾、肺、肾中为双等位基因表达,GTL2基因在体细胞核移植牛的部分组织中表达紊乱有可能是造成体细胞核移植牛器官发育异常和核移植效率低下的原因之一.

关键词：牛 GTL2 基因组印记体细胞核移植