调控BRG1表达对猪体细胞核移植胚胎发育影响的初步研究

作     者：仝毅 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李湘萍

授予年度：2023年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：BRG1基因 猪胎儿成纤维细胞 体细胞核移植 染色质开放性 体细胞重编程 

摘      要：BRG1是染色质重塑复合物SWI/SNF家族的核心催化亚基,具有解旋酶和ATP酶活性,在开放染色质、改变局部核小体定位和调控哺乳动物细胞基因转录(激活或抑制)以及体细胞重编程等方面起着至关重要的作用。目前对BRG1在体细胞核移植方面的作用研究尚为空白,为此,本试验以猪胎儿成纤维细胞为供体细胞,首先分析调控BRG1表达对供体细胞表观修饰相关基因表达及染色质开放程度的影响;随后进行体细胞核移植,探究供体细胞过表达BRG1对猪核移植胚胎发育的影响。研究结果为阐明BRG1对供体细胞表观遗传修饰状态的调控作用,进一步改善猪体细胞核移植效率奠定了基础。试验结果如下:一、调控BRG1表达对猪胎儿成纤维细胞表观修饰水平及染色质开放程度的影响1.采用免疫荧光和q RT-PCR方法分析表观遗传修饰相关基因的表达情况。免疫荧光结果显示,在血清饥饿处理组中,过表达BRG1后5-mC、H3K14ac表达水平升高,H3K9me3表达水平降低。q RT-PCR结果显示,过表达BRG1使DNMT1、HAT1的表达显著升高(P0.05),SVU39H1、SUV39H2、SETDB1的表达显著降低(P0.05)。2.供体细胞过表达BRG1对染色质开放程度和基因转录水平的影响。首先利用免疫荧光方法检测HP1α的表达水平,然后进行ATAC-seq和RNA-seq分析。免疫荧光结果显示,过表达BRG1会降低胎儿成纤维细胞HP1α的表达水平。ATAC-seq结果分析发现,过表达BRG1促使SMARCA4、NANOG、SOX2、MAP2K6、HIF1A基因的开放程度更高。RNA-seq结果显示,过表达BRG1与神经元的产生、发育以及自噬方面基因的相关性较高,并且差异上调基因富集在PI3K-AKT等信号通路。二、调控供体细胞BRG1表达对猪体细胞核移植胚胎发育的影响首先分析BRG1在体外成熟猪卵母细胞、孤雌激活和体细胞核移植早期胚胎中的表达模式,并探讨在供体细胞中过表达BRG1基因对猪核移植早期胚胎发育及相关基因表达的影响。q RT-PCR和免疫荧光结果显示,BRG1在体外成熟猪卵母细胞及孤雌激活胚胎的各个时期均有表达,在核移植胚胎中,与阴性对照组相比,BRG1在试验组的2-细胞和4-细胞时期表达显著升高(P0.05)。过表达BRG1基因能显著提高猪核移植胚胎的囊胚率(17.83%vs 27.33%,P0.05),并且显著提高NANOG、SOX2、EIF3A、TFIIA的表达(P0.05)。以上结果表明:BRG1可以促进SMARCA4、NANOG、SOX2、MAP2K6、HIF1A基因的开放程度,供体细胞中上调BRG1基因表达可提高猪体细胞核移植胚胎早期发育能力。