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巯基物质对牛卵母细胞体外成熟及体细胞克隆胚胎体外发育的影响

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巯基物质对牛卵母细胞体外成熟及体细胞克隆胚胎体外发育的影响

作者：李丽延边大学

学位级别：硕士

巯基物质在卵母细胞的体外成熟培养中是一种重要的成分,虽然在实验中已有人使用,但并没有系统的对巯基物质的种类,使用的剂量等对卵母细胞体外成熟培养的影响研究过。本实验主要研究半胱氨酸,谷胱甘肽(GSH),β-巯基乙醇,巯基乙胺对延边... 详细信息

巯基物质在卵母细胞的体外成熟培养中是一种重要的成分,虽然在实验中已有人使用,但并没有系统的对巯基物质的种类,使用的剂量等对卵母细胞体外成熟培养的影响研究过。本实验主要研究半胱氨酸,谷胱甘肽(GSH),β-巯基乙醇,巯基乙胺对延边黄牛卵母细胞的体外成熟及体细胞克隆胚胎体外发育的影响,从而提高延边黄牛体细胞克隆的效率。利用屠宰后剪取牛卵巢,用抽吸法回收卵母细胞,然后在不同种类,浓度巯基物质中进行卵母细胞的体外成熟培养,最后将成熟的卵母细胞经核移植所构建的重组胚进行体外培养。得出实验结果如下：1.在成熟液中添加不同浓度的半胱氨酸对延边黄牛卵母细胞体外成熟影响的试验中,添加0.56mmol／L组显著高于其它各组(P细胞体外成熟的最佳浓度。2.在成熟液中添加不同浓度的GSH对延边黄牛卵母细胞体外成熟影响的试验中,1.0mmol／L和1.5mmol／L两组之间差异不显著(P>0.05),但与其它组比较差异显著(P细胞体外成熟的最佳浓度。3.在成熟液中添加不同浓度的β-巯基乙醇对延边黄牛卵母细胞体外成熟影响的试验中,添加100umol／L与150umol／L两组之间差异不显著(P>0.05),但与其它各组比较差异显著(P细胞体外成熟的最佳浓度。4.在成熟液中添加不同浓度的巯基乙胺对延边黄牛卵母细胞体外成熟影响的试验中,添加100umol／L组与50umol／L组,150umol／L组差异不显著(P>0.05),但显著高于对照组和200umol／L组,所以确定100umol／L是单独使用巯基乙胺时最适合于延边黄牛卵母细胞体外成熟的最佳浓度。5.在成熟液中联合添加已确定浓度的药品对延边黄牛卵母细胞体外成熟影响的试验中,半胱氨酸和巯基乙胺联合添加组与半胱氨酸和β-巯基乙醇联合添加组之间差异不显著(P>0.05),但都显著高于对照组和GSH组(P细胞体外成熟。6.在成熟液中添加不同浓度的半胱氨酸对延边黄牛体细胞克隆效率影响的试验中,在卵裂率方面,0.56mmol／L组与0.28mmol／L组,0.84mmol／L组差异不显著(P>0.05),但与对照组和1.12mmol／L组差异显著(P0.05),但0.56mmol／L组显著高于对照组(P体细胞克隆的最佳浓度。7.在成熟液中添加不同浓度的GSH对延边黄牛体细胞克隆效率影响的试验中,在卵裂率上,1.0mmol／L与1.5mmol／L组之间差异不显著(P>0.05),但1.0mmol／L组显著高于其他各组(P0.05),但1.0mmol／L组显著高于对照组(P体细胞克隆的最佳浓度。8.在成熟液中添加不同浓度的β-巯基乙醇对延边黄牛体细胞克隆效率影响的试验中,在卵裂率上,100umol／L组与50umol／L组,150umol／L组差异不显著(P>0.05),但与对照组和200umol／L组差异显著(P0.05),但100umol／L组显著高于对照组(P体细胞克隆的最佳浓度.9.在成熟液中添加不同浓度的巯基乙胺对延边黄牛体细胞克隆效率影响的试验中,在卵裂率上,添加100umol／L组与50umol／L组,150umol／L组差异不显著(P>0.05),但显著高于对照组和200umol／L组,说明100umol／L效果最佳;在囊胚发育上,添加药物组之间差异不显著(P>0.05),但100umol／L组显著高于对照组(P体细胞克隆的最佳浓度。10.在成熟液中联合添加已确定浓度的药品对延边黄牛体细胞克隆效率影响的试验中,在卵裂率方面,半胱氨酸和巯基乙胺联合添加组与半胱氨酸和

关键词：延边黄牛巯基物质卵母细胞体细胞克隆胚胎体外成熟体外培养

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延边黄牛体细胞克隆胚胎的核型分析

延边黄牛体细胞克隆胚胎的核型分析

作者：吴昊延边大学

学位级别：硕士

为了从细胞遗传学的角度研究延边黄牛体细胞克隆胚胎的染色体,了解其遗传学特性,以期克服克隆动物的生理缺陷,为延边黄牛的繁育提供更为有效的细胞遗传学资料。本试验采用传统的细胞遗传学方法,利用延边黄牛体细胞克隆6～8天后产生的囊... 详细信息

为了从细胞遗传学的角度研究延边黄牛体细胞克隆胚胎的染色体,了解其遗传学特性,以期克服克隆动物的生理缺陷,为延边黄牛的繁育提供更为有效的细胞遗传学资料。本试验采用传统的细胞遗传学方法,利用延边黄牛体细胞克隆6～8天后产生的囊胚制备染色体标本,分析延边黄牛体细胞克隆胚胎的染色体及其核型,以及通过BSG法(Barium hydroxide/saline/Giemsa氢氧化钡-盐溶液-吉姆萨)与胰酶-EDTA法分别分析其C-带和G-带。结果表明:(1)延边黄牛体细胞克隆胚胎染色体数目为2n=60,雄性核型为60,XY;雌性核型为60,XX。其中,1～29对常染色体为端部着丝粒染色体,,X为较大的亚中部着丝粒染色体,Y为较小的中部着丝粒染色体。(2)C-带分析表明,阳性区出现在所有常染色体着丝粒部位和Y染色体上。染色特征为所有常染色体的着丝粒部位被深染,臂为浅染:X染色体不出现C带阳性区,整个被浅染;Y染色体为半深染,着色程度介于常染色体着丝粒部位深染区与长臂及X染色体浅染区之间。(3)G-带分析表明,G带明暗相间,显现出不同的带纹。本实验发现延边黄牛体细胞克隆胚胎的单倍体有200条阳性带纹,且每对染色体都有其独特的带纹特征,其带纹的数目和精细程度随着染色体长度的增加而增加。

关键词：延边黄牛体细胞克隆胚胎染色体 C-带 G-带

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体细胞克隆胚胎形态与质量相关性的研究

体细胞克隆胚胎形态与质量相关性的研究

全国首届动物生物技术学术研讨会

作者：雷安民敬晓棋严兴荣胥涛窦忠英西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心

应用体外成熟培养液(TCM199液内添加0.22mg/L丙酮酸钠,10mM Hepes,0.10IU/mL HMG,1mg/mL17β-E,10%胎牛血清)对山羊卵泡卵母细胞进行体外成熟培养,然后挑选具有第一极体的成熟卵母细胞,去核后与布尔山羊耳上皮细胞构建克隆胚胎。挑选成... 详细信息

应用体外成熟培养液(TCM199液内添加0.22mg/L丙酮酸钠,10mM Hepes,0.10IU/mL HMG,1mg/mL17β-E,10%胎牛血清)对山羊卵泡卵母细胞进行体外成熟培养,然后挑选具有第一极体的成熟卵母细胞,去核后与布尔山羊耳上皮细胞构建克隆胚胎。挑选成功融合的克隆胚胎在无血清培养系统下(B原装无血清培养液[法国CCD公司产品]+VERO细胞饲养层)进行体外培养。48小时后,将分裂的克隆胚胎分为三类,①形态正常的2-4细胞期胚胎,分裂球大小均匀,透明带内不含或含有很少的碎片:②为分裂的2-4细胞周胚胎,分裂球大小不均匀,透明带内含有较多的碎片:③超过4细胞期的胚胎,透明带内含有或不含有碎片。将上述三类克隆胚胎放入含Hochest3342 10μg/mL的TCM199液中培养5mins,然后在紫外荧光显微镜下检查分裂球内含有细胞核的情况(具有细胞核的分裂球内有激发荧光)。共进行5次实验,检查①类胚胎62枚,其中57枚胚胎内的每个分裂球中都含有细胞核,另外5枚胚胎中,至少有一个分裂球内没有细胞核;检查②类胚胎26枚,其中7枚胚胎内每个分裂球都含有细胞核,其余的胚胎至少都有一个分裂球内没有细胞核,检查显示有个别胚胎细胞核存在于透明带内的碎片中;检查③类胚胎30枚,其中只有2枚6细胞期胚胎内每个分裂球中都含有细胞核,其余大部分胚胎内,只有1个或2个分裂球含有细胞核。这一结果提示我们在克隆胚胎培养过程中,克隆胚胎的发育形态与质量高度相关,因此48h第一次更换培养液时,可以将②③两类胚胎弃去,只培养或者移植①类胚胎即可。我们利用这一标准挑选2-4细胞期胚胎经输卵管移植受体羊13只,其中有6只山羊超过60天没有返情,最终手术部腹证明有2只受体羊妊娠。

关键词：山羊体细胞克隆胚胎形态学

来源： cnki会议评论

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延边黄牛体细胞克隆胚胎的核型分析

延边黄牛体细胞克隆胚胎的核型分析

东北三省及内蒙古地区遗传学研究进展学术研讨会

作者：张宇吴昊方南洙李钟淑延边大学农学院

为了从细胞遗传学的角度研究延边黄牛体细胞克隆胚胎的染色体,了解其遗传学特性,以期克服克隆动物的生理缺陷,为延边黄牛的繁育提供更为有效的细胞遗传学资料。本试验采用传统的细胞遗传学方法,利用延边黄牛体细胞克隆6～8天后产生的囊胚制备染色体标本,分析延边黄牛体细胞克隆胚胎的染色体及其核型,以及通过BSG法(Barium hydroxide/saline/Giemsa氢氧化钡-盐溶液-吉姆萨)与胰酶-EDTA法分别分析其C-带和G-带。结果表明:(1)延边黄牛体细胞克隆胚胎染色体数目为2n=60,雄性核型为60, XY;雌性核型为60,XX。其中,1～29对常染色体为端部着丝粒染色体,,X为较大的亚中部着丝粒染色体, Y为较小的中部着丝粒染色体;(2)C-带分析表明,阳性区出现在所有常染色体着丝粒部位和Y染色体上。染色特征为所有常染色体的着丝粒部位被深染,臂为浅染;X染色体不出现C带阳性区,整个被浅染;Y染色体为半深染,着色程度介于常染色体着丝粒部位深染区与长臂及X染色体浅染区之间;(3)G-带分析表明,G带明暗相间,显现出不同的带纹。本实验发现延边黄牛体细胞克隆胚胎的单倍体有200条阳性带纹,且每对染色体都有其独特的带纹特征,其带纹的数目和精细程度随着染色体长度的增加而增加。

关键词：延边黄牛体细胞克隆胚胎染色体 C-带 G-带

来源： cnki会议评论

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小鼠体细胞核移植胚胎端粒酶活性的测定

小鼠体细胞核移植胚胎端粒酶活性的测定

作者：张日欣延边大学

学位级别：硕士

端粒酶作为生命的“生物钟”在胚胎发育的过程中起到了至关重要的作用,同时有保持染色体稳定性和细胞活性并能延长缩短的端粒。并且端粒酶对于研究体细胞克隆胚胎重编程有着重要意义。目的：为了解小鼠早期卵母细胞及体细胞核移植重构胚... 详细信息

端粒酶作为生命的“生物钟”在胚胎发育的过程中起到了至关重要的作用,同时有保持染色体稳定性和细胞活性并能延长缩短的端粒。并且端粒酶对于研究体细胞克隆胚胎重编程有着重要意义。目的：为了解小鼠早期卵母细胞及体细胞核移植重构胚(NT)早期端粒酶活性的变化特点,本研究对小鼠卵母细胞和体细胞核移植重构胚2-细胞,4-细胞,8-细胞,桑葚胚以及囊胚各阶段相对端粒酶活性变化规律。方法：依据PCR产物进行电泳,利用端粒酶重复序列扩增法(TRAP)-银染,电泳条带在成像系统下的光密度值,对总产品产量相对定量计算(TPG)。结果：1.阳性细胞对照标准条带中,相对端粒酶活性与细胞浓度呈正相关。2.小鼠卵母细胞、体内受精胚胎及核移植胚胎各细胞期端粒酶检测为阳性。随胚胎分裂端粒酶活性呈上升趋势,在囊胚期达到最高。在体内受精胚胎中,合.子期(1-cell)相对端粒酶活性较高。3.核移植胚胎与体内受精胚胎比较在2-细胞相对端粒酶活性有差异(P细胞、8细胞、桑葚胚、囊胚阶段无明显差异(P>0.05)。4.体内受精胚胎与核移植胚胎在各自胚胎发育过程中呈现相似的规律：2-细胞、4-细胞、8-细胞相对端粒酶活性差异不显著(P>0.05)。囊胚期相对端粒酶活性与各胚胎时期差异显著(P胚胎的单卵裂球相对活性呈总下降趋势到囊胚达最低。胚胎2-细胞期差异显著(P胚胎与体细胞重构囊胚的胚胎时期计数,体内受精胚胎单卵裂球细胞数多于体细胞核移植胚胎的囊胚,二者呈显著性差异(P<0.05)。

关键词：体细胞克隆胚胎端粒酶活性端粒重复序列法(TRAP) 银染法

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延边黄牛体细胞克隆无血清成熟液的研究

延边黄牛体细胞克隆无血清成熟液的研究

作者：毛晶延边大学

学位级别：硕士

使用无血清培养液来进行卵母细胞的体外成熟培养和胚胎的发育培养,尽管近年来有人在不断尝试,但是还存在一定的要改进的地方。本实验将屠宰后延边黄牛的卵巢从屠宰场取回,用手术剪刀将多余组织剪掉,之后用温度为38℃的生理盐水洗净,采... 详细信息

使用无血清培养液来进行卵母细胞的体外成熟培养和胚胎的发育培养,尽管近年来有人在不断尝试,但是还存在一定的要改进的地方。本实验将屠宰后延边黄牛的卵巢从屠宰场取回,用手术剪刀将多余组织剪掉,之后用温度为38℃的生理盐水洗净,采用抽吸法回收卵母细胞,在不同的无血清成熟液条件下进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养。实验分别对牛卵泡液(BFF,bovine follicularfluid)、聚乙烯醇(PVA,polyvinyl alcohol)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP,polyvinylpyrrolidone)、牛血清白蛋白(BSA,bovine serum albumin)等无血清成熟液进行了研究。得出的实验结果如下:1、在不同浓度的牛卵泡液对卵母细胞体外成熟及发育率的影响的实验中,添加10%BFF时的成熟率、卵裂率、4-6细胞发育率和8-16细胞发育率都要高于其他组,结果显示10%BFF是添加卵泡液的最佳浓度。2、在BFF是否灭活对卵母细胞体外成熟及发育率的影响的实验中,在成熟上没有显著差异;但是在卵裂率上差异显著。结果表明:卵泡液虽然可以代替血清,但是像血清一样灭活以后使用是没有必要的。3、在PVA的浓度对卵母细胞体外成熟及发育率的影响的实验中,成熟率1.0 mg/ml组最高,但和1.5mg/ml组之间没有差异,1.0mg/ml组在早期发育上较其他组要高,PVA的添加量大于1.5 mg/ml时,虽然卵裂,但都为异常胚胎,卵裂率要低于不添加组。所以1.0 mg/ml的PVA是卵母细胞体外成熟的最佳浓度。4、确定了PVA和BFF的最佳浓度后,将二者结合使用,经过PVA和BFF的结合添加,我们得到的结论是:将二者结合添加以后要明显好于不添加组合和单独添加组。5、在不同浓度的PVP对卵母细胞体外成熟及发育率的影响的实验中,经过实验测得:添加0.3%的PVP的成熟率、卵裂率和发育率综合考虑要好于其他组,所以适合卵母细胞体外成熟及发育的PVP的最好浓度是0.3%。6、在不同浓度的BSA对卵母细胞体外成熟及发育率的影响的实验中,经过实验测得:对卵裂率和发育率的影响综合考虑0.4 mg/ml组要好于其他组,但是PVP的浓度对卵母细胞的体外成熟的影响不大。所以适合卵母细胞体外成熟及发育的BSA的最好浓度是0.4mg/ml。7、经过各种无血清成熟液之间的比较的得到的结果是:成熟率各组之间没有差异,表示几种无血清成熟液在卵母细胞体外成熟上可以代替血清。在卵裂率和发育率方面10%BFF+PVA组和血清组没有差异,所以它是代替血清的最佳成熟液。

关键词：延边黄牛无血清成熟液卵母细胞成熟体细胞克隆胚胎体外发育