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HBcAg显性失活突变体质粒的构建及体外表达

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上海第二医科大学学报 2002年第3期22卷 218-220页

作者：吴大勇周霞秋王斌俞红郭清徐人欢郭强苏上海第二医科大学瑞金医院传染科上海200025 上海第二医科大学瑞金医院组胚教研室上海200025

目的探讨HBcAg显性失活突变体质粒pCDA4-C-GFP的构建及体外表达。方法选择编码乙肝核心抗原C基因片段及绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因片段,利用基因重组技术构建成DNA质粒pCDNA4-C-GFP,并将该质粒转染肝癌细胞株H... 详细信息

目的探讨HBcAg显性失活突变体质粒pCDA4-C-GFP的构建及体外表达。方法选择编码乙肝核心抗原C基因片段及绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因片段,利用基因重组技术构建成DNA质粒pCDNA4-C-GFP,并将该质粒转染肝癌细胞株HepG2。结果通过RT-PCR检测到其RNA的表达,Confocal观察到GFP绿色荧光。结论 HBcAg显性失活突变体质粒pCDNA4-C-GFP的构建成功可以进行对HBV作用的研究。

关键词：乙肝核心抗原显性失活突变体绿色荧光蛋白质检构建体外表达

CD44与ALDH1真核双表达质粒构建和体外表达

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CD44与ALDH1真核双表达质粒构建和体外表达

作者：吕艳天津医科大学

学位级别：硕士

[目的] 本实验以CD44及ALDH1基因及其表达产物为研究对象,构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1,并分别转染MCF-7细胞,观察实验各组CD44及ALDH1基因和蛋白表达情况及活性并进行统计学分析,用于以... 详细信息

[目的] 本实验以CD44及ALDH1基因及其表达产物为研究对象,构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1,并分别转染MCF-7细胞,观察实验各组CD44及ALDH1基因和蛋白表达情况及活性并进行统计学分析,用于以CD44及ALDH1为基础的肿瘤靶向治疗研究,为进一步实验提供理论支持。 [内容] 本课题主要由两部分组成：本文第一部分通过RT-PCR方法检测三种肿瘤细胞系MCF-7、PC3、A542中CD44及ALDH1目的基因的表达情况,依据实验结果选取合适细胞作为克隆目的基因片段的来源,通过DNA重组技术构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44、PBudCE4.1-ALDH1、 pBudCE4.1-CD44-ALDH1,并通过PCR、酶切、基因测序方法验证重组质粒构建是否成功。本文第二部分通过重组质粒转染MCF-7细胞,并细胞分组A：空白对照组B：空质粒组C:pBudCE4.1-CD44转染组D:pBudCE4.1-ALDH1转染组E:pBudCE4.1-CD44-ALDH1转染组,应用RT-PCR及Western blot检测目的基因CD44及ALDH1的体外表达变化;应用CCK-8法检测目的基因CD44与ALDH1对细胞增殖能力影响,MTT法检测其对细胞-基质粘附能力的影响,并应用统计学方法分析。 [方法] 1. MCF-7、PC3、A542三种肿瘤细胞系培养,并应用RT-PCR检测三种细胞系中基因CD44及ALDH1的表达情况。 2.依据上步检测结果选取MCF-7及A542细胞系作为外源基因克隆来源,应用RT-PCR获得目的基因：含Not1/XhoI酶切位点CD44转录子4及含HindⅢ/Xbal酶切位点ALDH1片段。 3.利用DNA重组技术构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、 pBudCE4.1-CD44. pBudCE4.1-ALDH1。 4.转化大肠杆菌DHa5后取阳性克隆子培养并提取质粒,应用PCR、酶切、基因测序等方法鉴定重组质粒。 5.上述重组质粒应用lp2000方法转染MCF-7细胞,并细胞分组A：空白对照组B：空质粒组C:pBudCE4.1-CD44转染组D:pBudCE4.1-ALDH1转染组E：pBudCE4.1-CD44-ALDH1转染组,应用RT-PCR及Western blot检测目的基因CD44及ALDH1的瞬时表达变化。 6.应用CCK-8及MTT法检测目的基因CD44与ALDH1对细胞增殖能力及细胞-基质粘附能力的影响,并应用统计学方法分析。 [结果] 1.RT-PCR结果显示：CD44在MCF-7、PC3中表达,在A542中未见表达;ALDH1仅在A542细胞中微弱表达,在PC3、MCF-7细胞中未见表达。 2.RT-PCR获取CD44转录子4及ALDH1基因片段。 3.构建获得真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、 pBudCE4.1-ALDH1。 4.经PCR、酶切、基因测序等方法鉴定重组质粒构建正确。 5.各组重组质粒的体外表达及活性检测显示：RT-PCR及Western blot行半定量分析表明：CD44蛋白水平的表达,A、B组与D、E组间差异有统计学意义(P表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P体外增殖实验显示：单基因转染组C组和D组细胞的增殖能力与A组、B组(未转染组细胞、空载体组)相比明显提高(P表达载体进行转染后,E组肿瘤细胞的基质粘附能力得到显著提高,且提高较单基因转染组C组和D组细胞更为明显(P表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1。 2.CD44及ALDH1基因及其表达产物使肿瘤细胞体外增殖能力提高、肿瘤细胞-基质粘附性增加,在肿瘤细胞的发生发展中起重要作用。 3.重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1用于多种肿瘤的基础研究,具有很好的前景。

关键词： MCF-7 CD44 ALDH1 RT-PCR 重组克隆转染体外表达 Western blot 细胞增殖

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人RANTES基因克隆及其体外表达

生物工程学报 2001年第3期17卷 349-351页

作者：曾庆平杨瑞仪冯丽玲符林春广州中医药大学热带医学研究所广州510405

An expected 276bp fragment of the gene precursor encoding the signal peptide and mature protein of human β chemokine RANTES was amplified by reverse transcription\|polymerase chain reaction (RT\|PCR) from RNA of PHA\|activated human peripheral blood lymphocytes.This putative interested gene was inserted directly into a T\|vector and the ligation was confirmed by restriction enzyme digestion.The sequence data of the cloned fragment showed that it was almost identical with published sequences of RANTES gene,except for only one nucleotide substitution within the signal peptide region.The \%in vitro\% expressed recombinant RANTES protein was detected by the chemiluminescence enzyme\|linked immune Dot blotting assay after combining the recombinant plasmid with the \%in vitro\% SP6/T7 transcription and translation system.The successful cloning and expression of RANTES gene should shed light on future′s gene therapy of AIDS.

关键词： RANTES 基因克隆体外表达艾滋病 β-趋化因子

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家畜防御素体内组织表达及体外表达研究进展

畜牧与饲料科学 2019年第4期40卷 52-57页

作者：魏薇李海军王鑫张齐政曹贵方内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018

防御素是广泛分布于动物、植物、昆虫体内的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗菌肽,在动物免疫调节及植物自身防御方面扮演着重要的角色。对防御素的概念、类型、结构特征、作用机理进行了综述,总结了防御素在牛、马、羊、猪、鹿、骆驼... 详细信息

防御素是广泛分布于动物、植物、昆虫体内的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗菌肽,在动物免疫调节及植物自身防御方面扮演着重要的角色。对防御素的概念、类型、结构特征、作用机理进行了综述,总结了防御素在牛、马、羊、猪、鹿、骆驼等家畜体内组织表达及体外表达研究进展,并对防御素在未来生物制药和畜牧饲料生产方面的应用前景进行了展望。

关键词：家畜防御素组织表达分布体外表达

重组SIRPα1的体外表达及其在红细胞CD47-SIRPα信号通路研究中的应用

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中国输血杂志 2018年第9期31卷 934-937页

作者：叶璐夷杨启修夏荣伟荀春志赵俸涌张嘉敏李勤王晨向东朱自严上海市血液中心上海200051 曲靖市中心血站

目的获得野生型信号调节蛋白α1（SIRPα1）功能结构域重组蛋白,以用于研究正常或异常红细胞的吞噬和清除中CD47-SIRPα信号通路的作用。方法全基因合成人源野生型SIRPα1 IgV结构域编码区;将合成片段构建入携带组氨酸（His）标签的pET-... 详细信息

目的获得野生型信号调节蛋白α1（SIRPα1）功能结构域重组蛋白,以用于研究正常或异常红细胞的吞噬和清除中CD47-SIRPα信号通路的作用。方法全基因合成人源野生型SIRPα1 IgV结构域编码区;将合成片段构建入携带组氨酸（His）标签的pET-21a大肠杆菌载体,获得重组表达载体。使用大肠杆菌BL21 （DE3）细胞体外表达重组SIRPα1,并通过亲和层析法纯化;利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定重组SIRPα1;采用基于ELISA的红细胞结合试验评估2名Rh缺失表型献血者与正常Rh表型个体对照在红细胞结合水平的差异;流式细胞术检测红细胞CD47表达;采用单因素方差分析对数据做统计分析。结果成功构建重组表达载体,纯化获得野生型重组SIRPα1。成功建立了基于ELISA的红细胞结合试验方法并应用于评估重组SIRPα1与红细胞的结合。伴随CD47表达量的明显降低,Rh缺失表型个体的红细胞和正常个体相比,其与重组SIRPα1的结合能力下降。结论 CD47-SIRPα信号通路可能在Rh缺失表型红细胞的清除中发挥了作用。

关键词：信号调节蛋白α1(SIRPα1) 重组蛋白 CD47-SIRPα信号通路体外表达红细胞结合试验

细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体及其体外表达

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眼科新进展 2006年第12期26卷 900-903页

作者：赵海生王一第三军医大学附属西南医院眼科重庆市400038

目的构建表达人类晶状体来源的上皮生长因子p52(lens epithelium derivedgrowthfactor p52,LEDGFp52)重组腺病毒载体,检测LEDGFp52重组腺病毒能否在真核细胞中有效表达目的基因。方法将LEDGFp52基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-... 详细信息

目的构建表达人类晶状体来源的上皮生长因子p52(lens epithelium derivedgrowthfactor p52,LEDGFp52)重组腺病毒载体,检测LEDGFp52重组腺病毒能否在真核细胞中有效表达目的基因。方法将LEDGFp52基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52,将腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52与5型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带LEDGFp52基因的重组腺病毒载体pAd-LEDGFp52,将pAd-LEDGFp52经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-LEDGFp52,将Ad-LEDGFp52体外转染293细胞,CPE法及Westernblot观察目的基因的表达。结果构建了表达LEDGFp52基因的重组腺病毒质粒,E.coli内成功同源重组腺病毒,在293细胞内包装产生重组腺病毒Ad-LEDGFp52,滴度可达5×1012PFU·L-1。在真核细胞中有效表达目的基因LEDGFp52,出现显著的CPE效应。结论成功构建表达LEDGFp52的重组腺病毒载体,为进一步进行LEDGF p52基因功能的研究提供了实验基础。

关键词： LEDGFp52基因腺病毒载体体外表达

Methylocorus sp.MP 688菌株glyA基因体外表达及功能研究

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浙江农业科学 2018年第6期59卷 1010-1014页

作者：孙宇桐邹琪琪孙菊鲜孙晓宇齐姗姗辛琪葛欣河北大学生命科学学院河北保定071002

Methylocorus sp.MP 688菌株具有高产吡咯喹啉醌的特性而应用于工业生产当中。分析其全基因组及代谢通路,发现在C1固定中丝氨酸循环起到重要的生理作用。为了研究丝氨酸循环中gly A基因是否具有表达丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxyme... 详细信息

Methylocorus sp.MP 688菌株具有高产吡咯喹啉醌的特性而应用于工业生产当中。分析其全基因组及代谢通路,发现在C1固定中丝氨酸循环起到重要的生理作用。为了研究丝氨酸循环中gly A基因是否具有表达丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)活性及基因缺失是否会对菌株生命活动产生影响。采用体外表达方式,纯化并检测gly A基因产物SHMT酶是否具有催化活性。通过双交换实验进行glyA基因敲除,探究gly A基因缺失是否会对菌株产生影响。结果表明,gly A基因成功在体外表达,双交换敲除实验证明glyA基因作为关键基因存在,其缺失或可致死。此外,SHMT酶在35℃,pH值7.5缓冲体系中酶促效率最高,还原剂β-巯基乙醇对SHMT酶催化活性具有促进作用。

关键词： glyA基因丝氨酸羟甲基转移酶体外表达双交换敲除

不同辅助因子对CYP1A2和POR体外表达的影响

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不同辅助因子对CYP1A2和POR体外表达的影响

小鼠白细胞介素5真核表达质粒pVAX-1mIL-5的构建及其体外表达

中国毒理学会第五次全国学术大会

作者：陆慧媛马骏刘年王守林南京医科大学公共卫生学院毒理学系现代毒理学教育部重点实验室

目的研究在Baculovirus/Sf9系统中体外表达CYP1A2和POR蛋白时,不同辅助因子Hemin、5-ALA和Fe3 +对表达效率及活性的影响,并尝试CYP1A2和POR的共表达,探寻稳定、高效表达高活性CYP1A2酶和POR的条件。方法使用分子克隆技术构建含有CYP1A2... 详细信息

目的研究在Baculovirus/Sf9系统中体外表达CYP1A2和POR蛋白时,不同辅助因子Hemin、5-ALA和Fe3 +对表达效率及活性的影响,并尝试CYP1A2和POR的共表达,探寻稳定、高效表达高活性CYP1A2酶和POR的条件。方法使用分子克隆技术构建含有CYP1A2和POR cDNA的重组质粒,并进行PCR和酶切验证;用该质粒转染昆虫细胞Sf9以获得含上述基因的杆状病毒。然后再进一步感染Sf9细胞,表达CYP1A2和POR蛋白。通过加入不同浓度5-ALA、Fe、Hemin或其组合,观察这些条件对蛋白表达水平和活力的影响。此外,将含CYP1A2或POR基因的杆状病毒按不同比例混合,联合感染Sf9细胞进行共表达。在此基础上,进一步分析5-ALA或(和)Fe对CYP1A2和POR共表达的影响,寻找最合适的体外表达条件。使用免疫印迹法检测蛋白质的表达情况;使用CO差示光谱法和细胞色素C还原法分别检测CYP1A2和POR的活性。结果同时加入0.1mM 5-ALA和0.1mM Fe时,CYP1A2蛋白的表达显著提高,相对于单独加入5-ALA、Fe或Hemin,分别增加了40%、65%和32%;对于POR蛋白,加入了5-ALA和/或Fe后表达量显著提高,分别相当于不加任何辅助因子时的2.13、1.71和1.86倍,以仅加入5-ALA时表达水平最高;同样的结果也反映在POR的活力上,加入5-ALA和/或Fe分别提高7.1倍、4.5倍和5.4倍。在Baculovirus/Sf9系统中进行CYP1A2和POR共表达时,当病毒比例为2.5:1或3:1时,无论CYP1A2还是POR,其表达量都显著增加,分别比2:1和4:1时提高约50%,且两者的表达比例较为适当;在CYP1A2:POR病毒比例为2.5:1的表达体系中,加入0.1和0.35mM 5-ALA时,CYP1A2和POR的表达量都显著高于0. 6mM;此外,加入0.1mM Fe时,蛋白表达也有较高水平;但有趣的是,当联合加入5-ALA和Fe时,蛋白的表达量反而下降,相关机制有待进一步研究。结论不同辅助因子对CYP450和POR的表达及活性有明显影响。联合加入5- ALA和Fe可显著增加CYP450的表达和活性;低浓度5- ALA或Fe、以及CYP1A2和POR病毒比例为2.5:1或3:1时,有利于两者的共表达。

关键词： CYP1A2 POR Baculovirus/Sf9表达系统辅助因子体外表达

来源： cnki会议评论

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生殖医学杂志 2005年第2期14卷 78-82页

作者：何柳媚潘善培谢琪璇肖銮娟彭雅琳董志炜暨南大学生殖免疫研究所广州510632

目的构建能表达小鼠白细胞介素5(mIL-5)的质粒并鉴定其蛋白的体外瞬时表达。方法以含有mIL-5cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得小鼠IL-5基因片段后,定向插入真核表达载体pVAX1中,获得重组表达质粒pVAX1mIL-5。通过双... 详细信息

目的构建能表达小鼠白细胞介素5(mIL-5)的质粒并鉴定其蛋白的体外瞬时表达。方法以含有mIL-5cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得小鼠IL-5基因片段后,定向插入真核表达载体pVAX1中,获得重组表达质粒pVAX1mIL-5。通过双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。采用间接免疫荧光技术检测pVAX1mIL-5在HeLa细胞的瞬时表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,插入片段正确,间接免疫荧光检测表明其可以在HeLa细胞中瞬时表达。结论构建的真核表达质粒pVAX1mIL-5可以在HeLa细胞中瞬时表达小鼠IL-5的蛋白,为下一步利用IL-5作为DNA疫苗黏膜免疫佐剂研究奠定了基础。

关键词：白细胞介素5 质粒构建体外表达黏膜免疫佐剂