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中药黄芦木的体内外代谢研究及其抗肉瘤网络药理学预测分析

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中药黄芦木的体内外代谢研究及其抗肉瘤网络药理学预测分析

作者：廖翠平天津中医药大学

学位级别：硕士

由于中药成分复杂多样,中药的药效物质基础和作用机制研究一直是围绕着科研学者的难解之题。众所周知,中药常以汤剂型式口服给药,口服药物一般要先通过胃肠道屏障,才能进入血液循环,在这一系列过程中,并非所有的中药成分均能进入血液循... 详细信息

由于中药成分复杂多样,中药的药效物质基础和作用机制研究一直是围绕着科研学者的难解之题。众所周知,中药常以汤剂型式口服给药,口服药物一般要先通过胃肠道屏障,才能进入血液循环,在这一系列过程中,并非所有的中药成分均能进入血液循环系统而产生药效,因此,最终进入血液循环的成分才是药效作用的潜在物质。近些年来,UPLC-Q-TOF-MS/MS技术由于高效能、高灵敏、快速的分离特点,己成为中药复杂体系中分析多成分及其代谢产物的重要技术手段。随着生物信息技术学的发展,网络药理学己成为中药作用机制研究的重要手段。黄芦木(Berberis amurensis Rupr)是小檗科(Berberidaceae)小檗属(Berberis)常绿灌木植物,其具有观赏价值和广泛的药理作用,民间常以其根和茎入药,用于治疗高血压,炎症,痢疾,肠炎,黄疸等疾病。现代药理研究表明,黄芦木对S180肉瘤的生长具有明显的抑制作用,然而,其化学成分及作用机制尚不明确。本课题将以黄芦木作为研究对象,通过体内外代谢研究,并以网络药理学分析来初步阐明黄芦木抗肉瘤的药效物质基础。本文的研究内容主要分成以下三个部分:1利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析黄芦木提取物的化学成分及其入血成分。(1)本实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合Peakview/Masterview数据处理软件对黄芦木化学物质组进行分析,分别于正、负离子模式下采集质谱信息,结果从黄芦木提取液中共分离出33个化合物,与数据库中化合物和对照品的质谱信息为进行比对分析,鉴定了28个化合物,其中包括17个生物碱、3个有机酸类、2个环烯醚萜类、2个木脂素类、1个香豆素类、1个糖脂类、1个核苷类、1个苷类化合物。(2)在确定黄芦木化学物质组的基础上,对黄芦木提取液进行入血成分分析。以SD大鼠为实验对象,收集大鼠给药后的血浆样品。采用色谱柱Synergi Fusion-RP100A(2.0 mm×100 mm,2.5μm),以0.05%甲酸乙腈(A相)-1mmol/L乙酸铵、0.05%甲酸水(B相)为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾离子源(ESI)正离子模式下进行检测,再利用Peakview/Masterview软件对黄芦木提取液、空白血浆、给药后血浆的图谱数据进行对比处理。结果从大鼠给药后血浆中检测到9个原型化合物和8个代谢成分,其中原型成分包括小檗碱、药根碱、腺苷、巴马汀、刺五加苷E、木兰花碱、粉防己碱、小檗胺和小檗红碱。2利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对黄芦木中主成分进行体内外代谢研究(1)首先利用联合抗生素建立伪无菌大鼠模型,比较正常大鼠和伪无菌大鼠尿、粪和胆汁中代谢产物的差异,以阐明肠道菌群对黄芦木代谢的作用。结果从正常大鼠中发现46个代谢产物,而在伪无菌大鼠中只检测到30个代谢产物,且伪无菌大鼠中无脱氢化代谢产物,实验结果表明黄芦木在肠道菌活性被抑制的伪无菌大鼠体内的代谢情况发生了变化。(2)采用离体粪便温孵法,将正常大鼠的粪菌液与黄芦木提取物在体外37℃恒温厌氧坏境中共同培养,分析黄芦木主成分被肠道菌群孵育24 h后的体外代谢情况,结果从肠道菌群孵育液中检测出了7个代谢产物,表明肠道菌群可以使黄芦木主成分发生生物转化。3利用网络药理学阐释黄芦木抗肉瘤的作用机制。运用中药系统药理学数据库(TCMSP)和Swiss Target Prediction数据库对黄芦木入血原型成分进行核心靶点预测,同时收集肉瘤相关疾病的靶点,基于PPI蛋白相互作用数据库对化合物-疾病共同靶点进行网络构建,再利用DAVID数据库收集与核心靶点相关的通路,并对其进行通路富集分析。研究结果表明黄芦木防治肉瘤的核心靶标蛋白有31个,主要涉及TP53、GAPDH、CCND1、ESR1、FOS、RELA、AR、SMAD3、HSP90AA1、H1F1A等,这些靶点的作用通路有癌症相关通路(如胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌等)、细胞的生长分化通路(如PI3K-AKt信号通路,细胞周期)、炎症相关的信号通路(如乙型肝炎、HTLV-I感染、麻疹等)。综上所述,本研究在明确了黄芦木的化学物质基础上,通过体内外代谢研究解释肠道菌群对黄芦木的代谢影响,并通过网络药理学构建“入血成分-靶标-通路”网络,阐释黄芦木抗肉瘤作用机制为黄芦木今后的药理研究和临床使用的进一步扩大奠定基础。

关键词：黄芦木 UPLC-Q-TOF-MS/MS 网络药理学化学成分体内外代谢

新疆石榴皮抗肿瘤多酚主要成分的体内外代谢及药代动力学研究

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新疆石榴皮抗肿瘤多酚主要成分的体内外代谢及药代动力学研究

作者：张慧慧新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题对石榴皮抗肿瘤多酚的主要成分安石榴苷和鞣花酸在大鼠体内外代谢和药代动力学进行了研究,为体内抗肿瘤活性成分确定提供药动学依据。方法:1、建立大鼠肠道菌群体外代谢模型,采用HPLC-ESI-TQ-MS检测技术,对安石榴苷在大鼠肠... 详细信息

目的:本课题对石榴皮抗肿瘤多酚的主要成分安石榴苷和鞣花酸在大鼠体内外代谢和药代动力学进行了研究,为体内抗肿瘤活性成分确定提供药动学依据。方法:1、建立大鼠肠道菌群体外代谢模型,采用HPLC-ESI-TQ-MS检测技术,对安石榴苷在大鼠肠道菌群中的代谢产物进行鉴定与分析。2、建立肝微粒体及肝S9片段体外代谢模型,采用UPLC-ESI-QTRAP-MS检测技术,对大鼠和豚鼠肝微粒体、大鼠肝S9片段中酯酶活性进行表征及比较,并采用UPLC-ESI-QTOF-MS检测技术,对安石榴苷和鞣花酸在大鼠肝微粒体Ⅰ相CYP450酶、酯酶和Ⅱ相UGT酶中的代谢产物进行鉴定与分析,分析代谢途径。3、大鼠灌服给药后,采集血浆、尿液、粪便及胆汁样品,采用UPLC-ESI-QTOF-MS检测技术鉴定、分析各生物样品中的代谢产物。4、安石榴苷采用大鼠口服给药途径,鞣花酸采用大鼠口服和静脉注射给药途径,于不同时间点眼内眦采血,二者分别应用HPLC检测技术、UPLC-ESI-QTRAP-MS检测技术分析血浆样品,药动学统计软件PK solution 2.0TM提取药动学参数。结果:1、建立了HPLC和LC-MS/MS检测方法,经HPLC方法检测,安石榴苷与大鼠肠道菌群共同孵育后几乎被完全代谢,且生成M1、M2及M3 3个代谢物,根据出峰时间初步推测及验证M3为鞣花酸;经LC-MS/MS进一步确认M3是鞣花酸,推测M2可能是Gallagic acid。2、建立了肝微粒体及肝S9片段体外代谢模型,采用UPLC-ESI-QTRAP-MS方法对大鼠和豚鼠肝微粒体、大鼠肝S9片段中酯酶催化产生的探针代谢产物进行测定与分析,结果表明,三者均具有酯酶活性,且豚鼠肝微粒体中酯酶活性与大鼠肝微粒体、大鼠肝S9片段中酯酶活性有显著性差异,但大鼠肝微粒体中酯酶活性与大鼠肝S9片段中酯酶活性无显著性差异;采用UPLC/ESI-QTOF-MS检测技术,对安石榴苷和鞣花酸在大鼠肝微粒体中的Ⅰ相、Ⅱ相代谢产物进行鉴定与分析,结果显示,安石榴苷共检测到M1-M6 6个代谢产物,初步推测产物M6可能是鞣花酸化合物,Ⅱ相和Ⅰ相代谢产物相同;鞣花酸共检测到1个代谢产物,且该代谢物可能为葡萄糖醛酸化代谢物。3、经UPLC-ESI-QTOF-MS检测技术分析,安石榴苷除了在血浆样品检测到2个代谢产物,初步推测可能是安石榴林和鞣花酸化合物,在尿液、粪便及胆汁样品中并未检测到相关代谢产物。鞣花酸在大鼠血浆、尿液、粪便及胆汁中均未检测到相关代谢产物。4、建立了HPLC和UPLC-ESI-QTRAP-MS定量检测方法。大鼠口服给予安石榴苷(给药剂量300mg/kg)后,血浆样品经HPLC定量方法检测,绘制了大鼠血浆中安石榴苷的血药浓度-时间曲线,主要药代动力学参数为:AUC(0-t)(243.40±111.62)ng·h·mL-1、T1/2a(42.03±0.8)h、T1/2d(2.68±1.76)h、T1/2e(18.87±17.92)h、Tmax(1.67±0.52)h、Cmax(26.33±5.65)ng·m L-1、Ka(0.42±0.25)h-1;口服(90.0mg/kg)和静脉注射(1.0mg/kg)给予鞣花酸后,血浆样品经UPLC-ESI-QTRAP-MS定量方法检测,分别绘制了口服和静脉注射给药大鼠血浆中鞣花酸的血药浓度-时间曲线,口服给药主要药代动力学参数为:AUC(0-t)(71.89±32.02)ng·h·m L-1、T1/2a(2.52±2.96)h、T1/2d(1.89±1.14)h、T1/2e(17.99±11.20)h、Tmax(1.11±1.30)h、Cmax(8.86±4.65)ng·m L-1、Ka(0.57±0.45)h-1,静脉注射给药主要药代动力学为:AUC(0-t)6(362.15±126.8)ng·h·m L-1、T1/2a(0.09±0.01)h、T1/2d(0.65±0.21)h、T1/2e(7.24±5.96)h、Tmax(0.03±0.00)h、Cmax(2512.29±640.13)ng·m L-1、Ka(7.64±0.83)h-1,此外,计算得到鞣花酸的绝对生物利用度为24.49%。结论:通过数据整合,安石榴苷在大鼠体内外共生成9个代谢产物,鞣花酸在大鼠体内外共生成1个代谢产物;通过对安石榴苷口服血药浓度的分析,其代谢过程为开放的二室模型,具有明显的吸收相、分布相和消除相;鞣花酸口服给药也符合二室模型;鞣花酸静脉注射给药后的血药浓度-时间曲线在消除相呈现急剧下降趋势,其可被迅速代谢;鞣花酸的绝对生物利用度较低,可能与其较强的亲脂性及肝首过效应有关。

关键词：安石榴苷鞣花酸大鼠肝微粒体体内外代谢药代动力学

文多灵在大鼠体内外代谢及对细胞色素P450酶活性影响的研究

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文多灵在大鼠体内外代谢及对细胞色素P450酶活性影响的研究

作者：张玉倩河北医科大学

学位级别：硕士

文多灵是从夹竹桃科长春花属植物长春花中分离得到的一种单吲哚类生物碱,主要存在于长春花叶片中,国内外民间均有用长春花叶及全草治疗糖尿病的历史,药理学研究发现长春花中的文多灵是其降血糖作用的活性成分。肝脏是药物在体内进行代... 详细信息

文多灵是从夹竹桃科长春花属植物长春花中分离得到的一种单吲哚类生物碱,主要存在于长春花叶片中,国内外民间均有用长春花叶及全草治疗糖尿病的历史,药理学研究发现长春花中的文多灵是其降血糖作用的活性成分。肝脏是药物在体内进行代谢转化的主要器官,细胞色素P450是存在于肝脏中的参与药物代谢转化的主要酶系,其催化药物代谢反应具有范围大、专属性差、立体结构差异大、底物重叠以及会被诱导和抑制等特点。药物联合应用时常因酶的诱导或抑制作用致使合用药物的体内代谢转化过程发生改变,从而产生药物-药物相互作用。因此对于药物及潜在药物而言,研究其可经哪些酶代谢以及对CYP450酶有怎样的影响十分必要,而文多灵关于此方面的研究尚未见报道。本文采用超高效液相色谱-质谱联用技术(UHPLC-QTOF-MS/MS),较系统地研究文多灵体内外代谢特征、介导代谢的亚型酶以及其对细胞色素P450酶活性的影响,为其临床安全合理应用提供科学依据。第一部分文多灵在大鼠肝微粒体CYP450酶中的代谢产物及代谢亚型酶的研究目的:建立UHPLC-QTOF-MS/MS法测定文多灵在大鼠肝微粒体孵育样品中的代谢产物,阐明文多灵在体外的代谢类型、代谢途径和参与其代谢的CYP450亚型酶。方法:(1)采用超高效液相色谱与质谱联用技术,研究文多灵的质谱裂解规律,为文多灵代谢产物分析鉴定的依据。(2)建立空白组、对照组和样品组大鼠肝微粒体温孵系统,考察文多灵体外代谢产物。空白组以等量甲醇代替文多灵溶液;对照组是以等量灭活的肝微粒体代替有活性的肝微粒体,样品组加入文多灵溶液;3组同法孵育。对各温孵样品进行涡旋离心,取上清液注入超高效液相色谱-质谱联用仪进行分析,参考文多灵的质谱裂解规律并结合收集得到的质谱数据,鉴定代谢产物的结构,推测代谢途径。(3)分别选取α-萘黄酮,盐酸苯海拉明,磺胺苯吡唑,奎尼丁,二乙基二硫代氨基甲酸胺,酮康唑作为CYP1A2,CYP2B,CYP2C11,CYP2D1,CYP2E1,CYP3A的特异性酶抑制剂,将文多灵和这些酶特异性抑制剂加入大鼠肝微粒体温孵液中共孵育,通过比较加入酶抑制剂前后的代谢产物生成量的变化,阐明与文多灵代谢相关的亚型酶。结果:共鉴定文多灵的体外代谢产物22个,甲基化,氧化,去甲基化和脱乙酰化是其主要代谢途径。CYP3A为文多灵的主要代谢酶,CYP1A2,CYP2B,CYP2C11,CYP2D1和CYP2E1也参与了文多灵的代谢。结论:本研究基于UHPLC-QTOF-MS/MS方法,成功发现和鉴定了文多灵大鼠体外代谢产物,同时确定了参与文多灵代谢的代谢亚型酶,为其进一步研究与开发利用提供参考。第二部分文多灵在大鼠体内代谢的研究目的:采用UHPLC-QTOF-MS/MS技术,分析大鼠口服给予文多灵后血浆、尿液、粪便和胆汁中代谢产物,同时确定文多灵在体内的代谢途径。方法:取健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,采用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液配制文多灵溶液,给药组灌胃给予文多灵溶液(20 mg·kg),空白组大鼠给予相同体积的CMC-Na溶液,采集给药后不同时间点的血浆、胆汁、尿液和粪便样品,采用乙酸乙酯萃取方法对样品进行前处理。运用UHPLC-QTOF-MS/MS技术分析处理后的样品,色谱柱为Poroshell 120 EC-C(2.1×100 mm,2.7μm);流动相为3 mM乙酸铵缓冲溶液-乙腈,梯度洗脱。高分辨质谱采用ESI+源,利用多重质量亏损摸板(MMDF)结合动态背景扣除(DBS)方法触发依赖信息数据采集。通过比较给药前后各样品的质谱数据,结合文多灵质谱裂解规律及多种数据后处理技术推测代谢产物结构,根据得到的代谢产物结构和类型,阐明文多灵在大鼠体内的代谢途径。结果:共鉴定文多灵的体内代谢产物25个,包括Ⅰ相代谢产物23个和Ⅱ相代谢产物2个,其中尿液中16个,胆汁中14个,粪便中12个,血浆中6个。文多灵在体内可能的代谢途径主要为去乙酰化反应、去甲基化反应、甲基化、氧化和硫酸酯化。结论:本研究应用UHPLC-QTOF-MS/MS技术,成功分析了文多灵大鼠体内代谢产物,阐明了文多灵的体内代谢规律,为其进一步的研究奠定了基础。第三部分文多灵对大鼠CYP450不同亚型酶体外代谢活性的影响目的:采用“cocktail”探针底物法评价文多灵在体外对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶活性的影响。方法:将文多灵分别与5种CYP450亚型酶(CYP1A2、CYP2B、CYP2C11、CYP2D1和CYP3A)的特异性探针底物他克宁、安非他酮、双氯芬酸钠、氢溴酸右美沙芬、咪达唑仑和大鼠肝微粒体进行孵育,采用UHPLC-QTOF-MS/MS法测定对应5种代谢产物1-羟化他克林、1-羟化安非他酮、4’-羟化双氯芬酸、O-脱甲基右美沙芬和1

关键词：文多灵体内外代谢细胞色素P450酶肝微粒体

蒙药协日嘎四味汤散及其有效成分姜黄素体内外代谢研究进展

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中国民族医药杂志 2021年第2期27卷 47-50页

作者：张小峰奥登其木格萨库拉乌尼尔吉日嘎拉阿拉腾其木格内蒙古自治区蒙医药研究所内蒙古呼和浩特010065 内蒙古医科大学内蒙古呼和浩特010110 蒙古国新医科大学

蒙药协日嘎四味汤散组方精简,配伍严谨,蒙医临床常用,而且疗效显著。姜黄作为蒙药协日嘎四味汤散君药,在此方剂中起着无法替代的作用。根据当前研究姜黄有姜黄素类及挥发油等多种活性成分,姜黄素类又分为姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱... 详细信息

蒙药协日嘎四味汤散组方精简,配伍严谨,蒙医临床常用,而且疗效显著。姜黄作为蒙药协日嘎四味汤散君药,在此方剂中起着无法替代的作用。根据当前研究姜黄有姜黄素类及挥发油等多种活性成分,姜黄素类又分为姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素。研究证实姜黄素是蒙药协日嘎四味汤散的主导药效成分之一,具备了抑菌、抗炎、镇痛、免疫调节、利尿、抗肿瘤等多种药理作用。研究还发现口服含姜黄素的药物后体内生物利用度和血药浓度较低、生物转化率高,对于协日嘎-4的临床疗效也有某种程度的影响。蒙药协日嘎四味汤散及其有效成分的体内外代谢研究不仅能够进一步确定其有效物质基础,而且能够为深入研究该药的药代动力学提供参考。

关键词：蒙药协日嘎四味汤散有效成分体内外代谢

HPLC-MS/MS分析黄连碱在大鼠体内外的代谢产物

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中国实验方剂学杂志 2020年第9期26卷 113-119页

作者：陈红影黄运芳刘起华郑伟李志慧陈建华戚婧张婷魏桂杰马鹏凯张玉杰北京中医药大学中药学院北京102488 中国中医科学院广安门医院北京100053

目的:探讨黄连碱的体内外代谢产物及其代谢途径。方法:体内代谢采用单次灌胃大鼠黄连碱(剂量25 mg·kg^-1),收集给药后0~48 h的尿液和粪便,0~24 h的胆汁以及给药0.25,1,2 h后的血浆和脑组织样品;体外代谢采用大鼠肝微粒体及肠道菌群孵... 详细信息

目的:探讨黄连碱的体内外代谢产物及其代谢途径。方法:体内代谢采用单次灌胃大鼠黄连碱(剂量25 mg·kg^-1),收集给药后0~48 h的尿液和粪便,0~24 h的胆汁以及给药0.25,1,2 h后的血浆和脑组织样品;体外代谢采用大鼠肝微粒体及肠道菌群孵育的方法;运用高分辨HPLC-MS/MS技术对生物样品中的药物原型及代谢物进行鉴定。选用ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速1.0 mL·min^-1,柱温25℃。质谱使用电喷雾离子源(ESI),正、负离子检测模式,扫描范围m/z 50~1200。对各色谱峰质谱图进行分析,根据准分子离子峰判断相对分子质量,进一步根据各色谱峰的主要碎片离子、保留时间等信息,与文献数据进行比较,推测化合物的结构。结果:在大鼠尿液、粪便、胆汁、血浆、脑组织、肝微粒体温孵和肠道菌群温孵样品中发现了黄连碱的17个代谢产物,Ⅰ相代谢产物11个,Ⅱ相代谢产物6个。这17个代谢产物是黄连碱在大鼠体内羟基化、去甲基化和脱氢作用、硫酸酯化、葡糖糖醛酸化后产生的。结论:黄连碱可在大鼠体内发生Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应,代谢物主要存在于尿液中,主要代谢部位为肝脏;黄连碱胃肠道吸收较差,代谢少,大部分经粪便以原型排泄,为黄连碱的药效学和药理学研究提供了一定的物质基础。

关键词：黄连碱代谢物体内外代谢葡糖糖醛酸化肝微粒体肠道菌群代谢途径

LC-MS/MS鉴定木兰花碱在大鼠体内外主要代谢产物

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药物评价研究 2021年第1期44卷 31-37页

作者：魏桂杰薛宝娟王宏雅张婷郑伟赵欣张玉杰北京中医药大学中药学院北京102488 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193

目的研究木兰花碱在大鼠体内外的主要代谢产物及代谢途径。方法SD大鼠ig木兰花碱(50 mg/kg),收集0~24 h尿液和粪便,0~6 h胆汁以及1、2、4、6、8 h血浆;体外代谢采用肝微粒体温孵系统和肠菌培养液。利用LC-MS/MS对生物样品中的原型药及... 详细信息

目的研究木兰花碱在大鼠体内外的主要代谢产物及代谢途径。方法SD大鼠ig木兰花碱(50 mg/kg),收集0~24 h尿液和粪便,0~6 h胆汁以及1、2、4、6、8 h血浆;体外代谢采用肝微粒体温孵系统和肠菌培养液。利用LC-MS/MS对生物样品中的原型药及代谢产物进行鉴定。采用Agilent TC-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,体积流量1.0 mL/min,柱温30℃。质谱采用电喷雾电离源(ESI),正离子采集模式;扫描范围m/z100~1000。根据药物体内代谢规则,结合木兰花碱的色谱保留时间和多级质谱碎片离子特征,推测其代谢产物的结构。结果给药后生物样品中共鉴定出12个代谢产物,其中Ⅰ相代谢产物8个,Ⅱ相代谢产物4个。主要的代谢途径为羟基化、去甲基化、脱氢作用、酮基化、葡萄糖化、葡萄糖醛酸化及硫酸酯化。结论木兰花碱在体内可发生Ⅰ相和Ⅱ相代谢,肠道菌群和肝药酶可催化木兰花碱发生Ⅰ相代谢转化,Ⅱ相代谢存在于肠道以外部位,最有可能的部位是肝脏。

关键词：木兰花碱代谢物体内外代谢肝微粒体肠道菌群代谢途径

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关节腔注射用雷公藤甲素微球组织分布与代谢

医药导报 2023年第11期42卷 1593-1600页

作者：王丽娟车坷科张稳稳丁永良姜理华重庆医药高等专科学校药学院重庆药物制剂工程研究中心重庆401331 重庆市人民医院药学部重庆400014

目的考察关节腔注射用雷公藤甲素微球(TPL-MS)健康大鼠组织分布与体内外代谢行为。方法建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法,测定不同时间点TPL-MS在大鼠心、肝、脾、肺、肾、血浆、关节的分布;以雷公藤甲素溶液(TPL-IN)为参比... 详细信息

目的考察关节腔注射用雷公藤甲素微球(TPL-MS)健康大鼠组织分布与体内外代谢行为。方法建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法,测定不同时间点TPL-MS在大鼠心、肝、脾、肺、肾、血浆、关节的分布;以雷公藤甲素溶液(TPL-IN)为参比,通过测定TPL-MS在大鼠肝匀浆和肝微粒体酶中代谢后的剩余量,计算不同时间点雷公藤甲素代谢百分比;对健康大鼠进行关节腔给药,采用高分辨质谱分析TPL-MS在大鼠肝脏、胆汁、尿液和粪便中的代谢物种类和代谢速度。结果给药后30 min,TPL-IN在肝匀浆和肝微粒体中分别下降50.32%、49.47%,TPL-MS分别下降47.62%、46.36%;体内外共观察到4种代谢物,两种制剂体内代谢途径和代谢物种类相似,TPL-IN主要代谢时间集中在给药后8 h,TPL-MS可在给药后0~24 h持续检出代谢物;TPL-MS给药后第3天在关节组织内达到最高浓度,维持时长接近2周。结论2种制剂体外代谢规律基本一致,体内代谢途径和代谢物种类一致。与TPL-IN相比,TPL-MS的组织分布和代谢速度发生明显改变,关节滞留时间延长,体内代谢过程延缓。

关键词：雷公藤甲素关节腔注射用微球体内外代谢组织分布

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苯并咪唑类抗棘球蚴前药的合成及其代谢研究

苯并咪唑类抗棘球蚴前药的合成及其代谢研究

作者：温爱丹中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

棘球蚴病(包虫病)是由棘球绦虫的幼虫寄生于人兽体内而引起的一类重要人兽共患疾病。我国是世界上棘球蚴病流行最严重的国家之一,最新的调查估计,我国棘球蚴病人数约40万人,其中受威胁人口达5000万人,主要流行于四川、青海、新疆、西藏... 详细信息

棘球蚴病(包虫病)是由棘球绦虫的幼虫寄生于人兽体内而引起的一类重要人兽共患疾病。我国是世界上棘球蚴病流行最严重的国家之一,最新的调查估计,我国棘球蚴病人数约40万人,其中受威胁人口达5000万人,主要流行于四川、青海、新疆、西藏和甘肃等(自治区)地区。我国的棘球蚴病主要有两种：一种是由细粒棘球绦虫幼虫感染所致细粒棘球绦虫病(囊型包虫病),另一种是由多房棘球绦虫幼虫感染所致多房棘球绦虫病(泡型包虫病)。苯并咪唑类药物阿苯达唑(Albendazole, Alb)和甲苯达唑(Mebendazole, Meb)自20世纪80年代用于治疗人棘球蚴病,开拓了化学药物治疗棘球蚴病的新途径,Alb和Meb是目前世界卫生组织(WHO)推荐的两种人棘球蚴病治疗药物。临床治疗中多选用Alb,但在动物实验中,Meb疗效更佳,对生发层细胞的作用更强。究其原因,是因为Meb在人体中胃肠道吸收更差,吸收率仅为5%-10%,生物利用度更低,仅约2.3%,需要长时间大剂量服药。因此,如果能够提高Meb的生物利用度,将可能大幅度地增加Meb的疗效。也有实验表明,在动物包虫病的治疗中,芬苯达唑(Fenbendazole, Fen)和奥芬达唑(Oxfendazole, Oxf)也表现出较好的疗效。对此类化合物疗效改善的探索从未停止过,主要通过改进其剂型以期提高疗效。但迄今为止,剂型改善尚不能缩短疗程和降低药物副作用,血药浓度难以呈指数性增加,很难从根本上改变包虫病治疗的现状。前药可改变药物作用时间和酯水分布系数以及提高溶解度和膜通透性等。“前药”一词最早是1958年由Albert提出的,在世界范围内已批准的药物中,约5%-7%可以归为前药,作为一种药物优化策略,前药广泛应用于肿瘤、心血管、神经系统以及感染性疾病等药物的研究,主要改善药物渗透性、溶解性及生物利用度等。一抗棘球蚴苯并咪唑前药的合成从常用的官能团修饰策略出发,设计Meb酰胺前药化合物1和2以及Fen开环硫脲类前药化合物3,通过SCiFinder数据库查找类似反应路线,合成目标化合物,并摸索反应条件,对目标化合物进行分离纯化,经液相-质谱(Mass Spectrometer, MS)和核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)鉴定其结构和纯度,为以后的生物学实验奠定基础。二抗棘球蚴苯并咪唑前药体外代谢建立了所合成前药化合物1和2以及化合物3的高效液相色谱(HPLC)测定方法。配制pH1.5和pH3.5两种酸性溶液以及人工胃液、人工肠液和小鼠肝脏匀浆三种生物基质,加入待测化合物于37℃恒温振荡器孵育,在不同时间点取样分析,观察前药在这些生物基质中的代谢,绘制代谢曲线。化合物1不稳定,在常温下即分解。化合物2在5种溶液中均产生了代谢,但没有生成目标代谢物,即Meb。化合物3在这三种生物基质中均产生了代谢,但只在肝脏匀浆观察到目标代谢物Fen,最大代谢率为7.92%。三抗棘球蚴苯并咪唑前药体内代谢建立了合成的几种化合物血药浓度HPLC测定方法。制备前药化合物2的西黄耆胶混悬液灌服小鼠,于不同时间点采血进行高效液相分析,在血浆样品中没有观察到化合物2和目标代谢物Meb。以同样的实验方法,灌喂化合物3,在血浆样品中也没有观察到前药化合物3和目标代谢物Fen。但对口服化合物3的小鼠胃内容物进行分析,同时观察到了前药化合物3、代谢物Fen以及Fen的代谢物Oxf。四苯并咪唑前药的体外抗棘球蚴活性测试采集含细粒棘球蚴原头节的囊液,用96孔培养板进行体外培养,每种化合物分别加入其中3孔,观察原头节的活动和体表损害情况,3天后,用美兰染色法计算原头节死亡率。化合物2在20gg/mL浓度下,体外细粒棘球蚴原头蚴死亡率同Meb,为100%,在10μg/mL浓度下,细粒棘球蚴原头蚴死亡率为100%,高于相同浓度下加入Meb的原头节死亡率70.5%。化合物3在10μg/mL浓度下细粒棘球蚴原头蚴死亡率为45.9%,低于同浓度Fen的100%。

关键词：棘球蚴病苯并咪唑前药 HPLC法体内外代谢原头节

脱氧鸭嘴花碱改善学习记忆作用及其药物动力学研究

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脱氧鸭嘴花碱改善学习记忆作用及其药物动力学研究

作者：邓钢上海中医药大学

学位级别：硕士

1.背景与目的:骆驼蓬(Peganum harmala Linn)是一种多年生草本植物,在中国、中东和南亚等地区被广泛用于治疗癫痫、偏瘫、健忘、神经痛、高血压、哮喘、皮下肿瘤、瘙痒和多种慢性疼痛。在以往的研究中,从骆驼蓬植物中发现了两类生物碱(... 详细信息

1.背景与目的:骆驼蓬(Peganum harmala Linn)是一种多年生草本植物,在中国、中东和南亚等地区被广泛用于治疗癫痫、偏瘫、健忘、神经痛、高血压、哮喘、皮下肿瘤、瘙痒和多种慢性疼痛。在以往的研究中,从骆驼蓬植物中发现了两类生物碱(β-咔波啉生物碱和喹唑啉类生物碱),β-咔波啉生物碱因其对单胺氧化酶(MAO)、乙酰胆碱酯酶(ACh E)和丁酰胆碱酯酶(BCh E)的强可逆性抑制作用,能够显著地改善学习记忆,在治疗精神疾病和神经退行性疾病方面具有较好的潜力。但是随后研究发现β-咔波啉生物碱具有潜在的中枢神经系统毒性,并引起震颤、幻觉等副作用。十分值得关注的是另一类喹唑啉类生物碱并没有相关副作用,其中脱氧鸭嘴花碱(Deoxyvasicine,DVAS)是骆驼蓬植物中活性喹唑啉生物碱的主要代表性成分之一,现代研究发现其具有抗菌、止咳平喘、杀虫等药理作用。课题组前期研究发现DVAS也是一种较强的胆碱酯酶抑制剂,其体外抗丁酰胆碱酯酶抑制活性比骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱及鸭嘴花碱(Vasicine,VAS)强,是一种潜在的具有抗老年痴呆作用的化合物。但是,关于DVAS抗老年痴呆药效作用及其体内外代谢、药物动力学并没有报道,因此,本文采用中药药理学、中药代谢动力学、分析化学等原理和技术,对DVAS开展药效、药代动力学等研究,以期阐明DVAS改善学习记忆作用机制及其体内过程,为其新药研发提供参考。2.方法(1)DVAS改善学习记忆作用机制研究:利用东莨菪碱腹腔注射C57BL/6小鼠,得到获得性记忆障碍模型,采用Morris水迷宫实验,考察DVAS对记忆损伤模型小鼠行为学的影响。动物分为6组:空白对照组、模型组、阳性对照组(石杉碱甲,0.2 mg/kg)、DVAS低(5 mg/kg)、DVAS中(15 mg/kg)、DVAS高(45 mg/kg)剂量组。在连续给予相应药物7天后,除空白组外(注射生理盐水),剩余5组在第8天开始每天固定于灌胃给药30 min后,腹腔注射1 mg/kg东莨菪碱,持续7天,于第15天进行水迷宫空间搜索实验,次日于腹腔注射东莨菪碱30 min后进行动物大处理,取小鼠海马、皮层组织。之后,通过酶联免疫吸附实验、组织病理切片、蛋白质印迹法等药理学技术对相关酶活性、炎症因子、氧化应激因子及蛋白表达进行初步研究。此外,利用课题组前期神经递质定量分析方法,对C57BL/6小鼠的脑组织中神经递质的含量进行检测,初步探讨DVAS对脑内重要神经递质的影响。(2)脱氧鸭嘴花碱体内外代谢研究:对DVAS在大鼠肝微粒体体外Ⅰ、Ⅱ相共孵育体系中,并以大鼠口服40 mg/kg DVAS后,收集血浆、胆汁、尿液及粪便样品,利用UPLC-QTOF-MS/MS对代谢产物进行初步结构鉴定,对DVAS体内外代谢轮廓和代谢特征进行考察。(3)脱氧鸭嘴花碱及代谢产物在大鼠体内的药物动力学研究:建立和验证大鼠血浆中DVAS及其代谢产物含量测定的UPLC-MS/MS方法,对静脉和口服给予DVAS后,大鼠血浆中DVAS及其代谢产物的药物动力学进行研究,获得口服给药后的绝对生物利用度及其他主要药动学参数,并对入血原型和代谢产物的胆碱酯酶抑制作用进行相关性分析,探讨其体内主要胆碱酯酶抑制活性成分。3.结果:(1)脱氧鸭嘴花碱改善学习记忆作用机制研究:以东莨菪碱诱导学习记忆损伤造模,结合Morris水迷宫小鼠行为学评价实验显示,DVAS对东莨菪碱所致记忆获得性障碍具有明显的改善作用。研究结果显示,连续7天腹腔注射东莨菪碱(1mg/kg)后,在定位航行训练的第4-5天,模型组小鼠的游泳路程与上台潜伏期较对照组明显的增加,均表现出显著的统计学差异(P<0.01)。在腹腔注射东莨菪碱的同时,给予小鼠DVAS低、中、高剂量的三组动物中,小鼠的游泳路程和上台潜伏期会随着定位航行训练天数的增加而逐渐减少,且在定位航行训练的第4-5天,与模型组相比均显著降低(P<0.05,P<0.01或P<0.01)。在空间探索实验中,模型组小鼠的上台次数较对照组明显降低(P<0.01)。而DVAS低、中、高剂量组的穿台次数较模型组,均有显著的增加(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。综合上述实验结果,DVAS对东莨菪碱诱导的记忆损伤模型小鼠的空间记忆能力表现出显著的改善作用,且具有一定的剂量依赖性。与对照组相比,东莨菪碱能使小鼠皮层和海马中ACh E的活性均有显著的增加(P<0.01或P<0.001),而Ch AT和BDNF的活性明显降低(P<0.01)。给予DVAS后,皮层和海马中ACh E的活性均有显著的降低(P<0.05,P<0.01或P<0.001),而且海马中Ch AT、BDNF的活性均有明显增加(P<0.05,P<0.01或P<0.001),且高剂量组的增加作用最为显

关键词：脱氧鸭嘴花碱改善学习记忆老年痴呆症体内外代谢药代动力学