中药黄芦木的体内外代谢研究及其抗肉瘤网络药理学预测分析

作     者：廖翠平 

作者单位：天津中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：侯文彬;樊慧蓉

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：黄芦木 UPLC-Q-TOF-MS/MS 网络药理学 化学成分 体内外代谢 

摘      要：由于中药成分复杂多样,中药的药效物质基础和作用机制研究一直是围绕着科研学者的难解之题。众所周知,中药常以汤剂型式口服给药,口服药物一般要先通过胃肠道屏障,才能进入血液循环,在这一系列过程中,并非所有的中药成分均能进入血液循环系统而产生药效,因此,最终进入血液循环的成分才是药效作用的潜在物质。近些年来,UPLC-Q-TOF-MS/MS技术由于高效能、高灵敏、快速的分离特点,己成为中药复杂体系中分析多成分及其代谢产物的重要技术手段。随着生物信息技术学的发展,网络药理学己成为中药作用机制研究的重要手段。黄芦木(Berberis amurensis Rupr)是小檗科(Berberidaceae)小檗属(Berberis)常绿灌木植物,其具有观赏价值和广泛的药理作用,民间常以其根和茎入药,用于治疗高血压,炎症,痢疾,肠炎,黄疸等疾病。现代药理研究表明,黄芦木对S180肉瘤的生长具有明显的抑制作用,然而,其化学成分及作用机制尚不明确。本课题将以黄芦木作为研究对象,通过体内外代谢研究,并以网络药理学分析来初步阐明黄芦木抗肉瘤的药效物质基础。本文的研究内容主要分成以下三个部分:1利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析黄芦木提取物的化学成分及其入血成分。(1)本实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合Peakview/Masterview数据处理软件对黄芦木化学物质组进行分析,分别于正、负离子模式下采集质谱信息,结果从黄芦木提取液中共分离出33个化合物,与数据库中化合物和对照品的质谱信息为进行比对分析,鉴定了28个化合物,其中包括17个生物碱、3个有机酸类、2个环烯醚萜类、2个木脂素类、1个香豆素类、1个糖脂类、1个核苷类、1个苷类化合物。(2)在确定黄芦木化学物质组的基础上,对黄芦木提取液进行入血成分分析。以SD大鼠为实验对象,收集大鼠给药后的血浆样品。采用色谱柱Synergi Fusion-RP100A(2.0 mm×100 mm,2.5μm),以0.05%甲酸乙腈(A相)-1mmol/L乙酸铵、0.05%甲酸水(B相)为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾离子源(ESI)正离子模式下进行检测,再利用Peakview/Masterview软件对黄芦木提取液、空白血浆、给药后血浆的图谱数据进行对比处理。结果从大鼠给药后血浆中检测到9个原型化合物和8个代谢成分,其中原型成分包括小檗碱、药根碱、腺苷、巴马汀、刺五加苷E、木兰花碱、粉防己碱、小檗胺和小檗红碱。2利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对黄芦木中主成分进行体内外代谢研究(1)首先利用联合抗生素建立伪无菌大鼠模型,比较正常大鼠和伪无菌大鼠尿、粪和胆汁中代谢产物的差异,以阐明肠道菌群对黄芦木代谢的作用。结果从正常大鼠中发现46个代谢产物,而在伪无菌大鼠中只检测到30个代谢产物,且伪无菌大鼠中无脱氢化代谢产物,实验结果表明黄芦木在肠道菌活性被抑制的伪无菌大鼠体内的代谢情况发生了变化。(2)采用离体粪便温孵法,将正常大鼠的粪菌液与黄芦木提取物在体外37℃恒温厌氧坏境中共同培养,分析黄芦木主成分被肠道菌群孵育24 h后的体外代谢情况,结果从肠道菌群孵育液中检测出了7个代谢产物,表明肠道菌群可以使黄芦木主成分发生生物转化。3利用网络药理学阐释黄芦木抗肉瘤的作用机制。运用中药系统药理学数据库(TCMSP)和Swiss Target Prediction数据库对黄芦木入血原型成分进行核心靶点预测,同时收集肉瘤相关疾病的靶点,基于PPI蛋白相互作用数据库对化合物-疾病共同靶点进行网络构建,再利用DAVID数据库收集与核心靶点相关的通路,并对其进行通路富集分析。研究结果表明黄芦木防治肉瘤的核心靶标蛋白有31个,主要涉及TP53、GAPDH、CCND1、ESR1、FOS、RELA、AR、SMAD3、HSP90AA1、H1F1A等,这些靶点的作用通路有癌症相关通路(如胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌等)、细胞的生长分化通路(如PI3K-AKt信号通路,细胞周期)、炎症相关的信号通路(如乙型肝炎、HTLV-I感染、麻疹等)。综上所述,本研究在明确了黄芦木的化学物质基础上,通过体内外代谢研究解释肠道菌群对黄芦木的代谢影响,并通过网络药理学构建“入血成分-靶标-通路网络,阐释黄芦木抗肉瘤作用机制为黄芦木今后的药理研究和临床使用的进一步扩大奠定基础。