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遗传 2024年第2期46卷 126-139页

作者：栾洋尤馨悦杨劲上海交通大学医学院公共卫生学院上海200025 中国药科大学药学院南京210009

体细胞突变的累积与衰老、肿瘤及多种疾病的发生密切相关。在正常组织细胞中,基因组中自发突变和诱发突变的变异等位基因频率极低,对这类低频突变的检测一直面临挑战。第二代和第三代高通量测序(next-generation sequencing,NGS)技术的... 详细信息

体细胞突变的累积与衰老、肿瘤及多种疾病的发生密切相关。在正常组织细胞中,基因组中自发突变和诱发突变的变异等位基因频率极低,对这类低频突变的检测一直面临挑战。第二代和第三代高通量测序(next-generation sequencing,NGS)技术的出现,可以实现任意物种全基因组上变异的直接检测,克服传统突变检测技术的诸多局限性。但是常规NGS由于测序错误率较高从而限制了其在低频突变检测上的应用,基于分子一致性测序策略进行错误矫正的高准确性NGS测序技术作为有效的低频突变检测工具,有望在环境诱变剂的评价与研究、细胞与基因治疗药物风险评估、人群健康风险监测和生命科学基础研究领域发挥重要作用。本文对比经典突变检测方法,对基于NGS的低频突变检测技术研究进展进行综述,并对应用前景进行展望,以期为该技术的进一步开发、研究和在相关领域的应用提供参考。

关键词：高通量测序技术低频突变分子一致性测序致突变风险评估

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基于DNBSEQ高通量测序技术的低频突变检测准确性的研究

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作者：刘哲郑州大学

学位级别：硕士

研究背景:DNBSEQ高通量测序技术广泛应用于科研和临床领域,包括全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS)、全外显子组测序(whole-exome sequencing,WES)以及特殊靶向区域的测序(panelsequencing)。随着高通量测序技术的迅速发展以及... 详细信息

研究背景:DNBSEQ高通量测序技术广泛应用于科研和临床领域,包括全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS)、全外显子组测序(whole-exome sequencing,WES)以及特殊靶向区域的测序(panelsequencing)。随着高通量测序技术的迅速发展以及在肿瘤等疾病研究中的应用,人们对突变精准检测的要求变得越来越高,特别是低频突变的精准检测。但是由于样本类型、测序深度等条件的限制,过滤假阳性突变并且准确识别样本的真实低频突变仍是一个很大的挑战,因此通过一些有效的方法提高低频突变的精准检测显得尤为重要。研究目的:本文对DNBSEQ高通量测序技术下可以提高低频突变精准检测的方法进行了探索和研究,包括特殊的双端唯一标签(unique dual barcode,UDB)、分子标签(unique molecular identifier,UMI)以及测序深度。方法:首先,对32个已知序列的DNA片段进行单barcode和UDB文库制备并混合上机测序,对比两种文库的污染率(标签跳跃)。其次,利用分子标签(UMI)对理论突变频率分别为1%、0.5%和0.2%肺癌循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)标准品以及8名宫颈癌患者的ctDNA进行变异检测分析,分析UMI技术对真实低频突变检出的影响。最后,通过对理论突变频率为3%的NA12878、理论突变频率分别为1%、3%和5%的ctDNA标准品以及源自C57BL/6小鼠的配对的冷冻组织(fresh-frozen,FF)和福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)的DNA进行高深度测序,分析了不同测序深度对低频突变频率保真度及灵敏度的影响,对测序深度标准化模型的建立进行了研究。结果:***技术在解决样本串扰方面比单barcode更有优势,单barcode样本间的串扰(即污染率)为0.058%,而UDB的则显著下降可低至0.0063%,极大的降低了对低频突变检测的干扰。2.使用UMI技术对理论突变频率为1%、0.5%和0.2%的ctDNA标准品进行变异检测分析时,去除了假阳性突变背景的干扰,提高了检测的准确度。真实突变的检出率分别为100%(7/7),85.7%(6/7)和83.3%(5/6),而且宫颈癌术前术后ctDNA突变数量的变化以及ctDNA与组织的突变检测一致性情况证明了 UMI技术在临床的应用价值。3.基于二项式分布建立起不同低频突变-测序深度-灵敏度的标准化关系,阐明了测序深度与实际检测突变频率保真度的关系。理论突变频率分别为3%的NA12878以及1%、3%和5%的ctDNA标准品中,实际检测突变频率围绕理论突变频率规律性波动,测序深度越高,实际检测突变频率的波动越小且更趋近理论突变频率值即保真度提高,进而提高了检测灵敏度。用小鼠样本对上述规律进行验证,当提高FF和FFPE真实样本的深度时,二者突变的一致性亦有显著提升。结论:***技术极大程度上解决了样本的串扰问题,为低频突变的精准检测奠定基础。***技术可以准确分辨样本中的真实突变和假阳性突变,提高低频突变检测的精准度。3.测序深度的提高增加了低频突变频率的保真度以及检测的灵敏度,而测序深度的标准化有助于低频突变的精准检测。

关键词： DNBSEQ高通量测序 UDB UMI 测序深度低频突变

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双重测序法结合芯片捕获检测低频突变的方法的建立

双重测序法结合芯片捕获检测低频突变的方法的建立

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作者：李巧玲华南理工大学

学位级别：硕士

液体活检,即通过血液或者体液检测肿瘤循环DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),获得肿瘤基因突变的信息,具有非侵入性、取样方便、可持续监测的特点,是肿瘤个体化治疗的重要工具。由于ctDNA具有的含量一般低于1%,并且肿瘤呈现高度异质性... 详细信息

液体活检,即通过血液或者体液检测肿瘤循环DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),获得肿瘤基因突变的信息,具有非侵入性、取样方便、可持续监测的特点,是肿瘤个体化治疗的重要工具。由于ctDNA具有的含量一般低于1%,并且肿瘤呈现高度异质性,而新一代测序技术存在约1%的错误率,使突变信息难以被准确检测到。双重测序法利用文库片段两端的随机标签组合去除测序错误,可以将测序准确度提高10000倍以上。因此本文利用6个已知突变频率的尿液来验证双重测序法结合芯片捕获技术的灵敏度,并用1例膀胱癌手术前后的尿液样本来证明该方法在肿瘤液体活检的可行性。本文探讨研究了双重测序法结合芯片捕获技术的灵敏度,以及方法在真实样本检测中的可行性。方法的灵敏度:在正常人尿液提取的DNA中加入1%,0.1%,0.01%的胃癌823细胞系DNA(拥有90个已知的突变位点)作为模拟样本,通过双重测序法和包含胃癌细胞系DNA 90个突变的芯片来建库捕获,检测混合样品里的突变位点。检测膀胱癌突变的可行性:用双重测序法结合芯片捕获技术对1例膀胱癌患者术前和术后的尿液DNA,一个正常人的尿液DNA进行检测,比较3个样品的基因突变情况。灵敏度测试的结果显示,在3个梯度的突变率中均能检测出突变,测序深度达到8000x时,含1%突变的样本的真实突变检出率大于66%,准确率大于93%。该方法用于检测膀胱癌突变时,芯片捕获率约60%,在病人术前、术后和正常人的尿液DNA中分别找到了39个,1个和4个突变位点。本研究说明,双重测序法是一个能够检测到0.01%低频突变的方法,结合芯片捕获技术,可特异性地检测膀胱癌尿液样本中疾病相关的基因突变位点。双重测序结合芯片捕获技术检测低频突变,是一个有发展潜力并且比较新的方法,需要更多的样本和数据支持,让它可以更好更广泛地应有。

关键词：肿瘤循环DNA 低频突变双重测序芯片捕获

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微量DNA靶向富集新方法的研究

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作者：汪泽鑫东南大学

学位级别：硕士

血浆游离DNA(cell free DNA,cf DNA)是体液中游离的、来源于人体细胞的片段化DNA,携带了人体基因信息和表观遗传信息等。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)则来源于肿瘤细胞,包含了肿瘤特有的基因信息和表观遗传信息,如单碱基... 详细信息

血浆游离DNA(cell free DNA,cf DNA)是体液中游离的、来源于人体细胞的片段化DNA,携带了人体基因信息和表观遗传信息等。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)则来源于肿瘤细胞,包含了肿瘤特有的基因信息和表观遗传信息,如单碱基突变,拷贝数变异及甲基化等。cf DNA作为液体活检的一项分子标志物,其无创、便捷的特性,在针对个体生理、病理状态等方面具有广阔的应用前景,尤其为肿瘤的诊断、预后、治疗及长期监测提供了重要依据。然而,当前针对ct DNA中变异有限的检测准确度限制了其在临床上的大规模应用,主要是单位体积全血中包含的cf DNA量少,ct DNA的突变频率低,且二代测序的检测限为1%,满足不了对低频突变的准确检测。滚环扩增作为一种等温扩增技术,在具有链置换特性的聚合酶作用下,其始终以初始环DNA为模板进行扩增的特性,保证了每一轮扩增产生的错误不会传递给下一轮扩增,最终通过对产物的测序获得模板DNA的一致性序列。本实验将探索滚环扩增对微量cf DNA和低频突变的富集效率。本研究分为三个部分:(1)微量DNA的文库构建;(2)滚环扩增体系的探索;(3)滚环扩增技术对微量DNA的富集和低频突变检测能力的验证,及其与传统文库构建方法的比较。首先,我们通过连接法和多重PCR两种传统的文库构建方法对微量DNA进行建库,并通过双链DNA环化和单链DNA环化两种环DNA建库方法对微量DNA进行文库构建。接着,在具有链置换特性的DNA聚合酶和特定引物的介导下,对环DNA进行滚环扩增。最后,利用滚环扩增对微量DNA进行富集,并在cf DNA中设置了1:100和1:200两种突变频率的内参基因,以验证滚环扩增对cf DNA中低频突变的放大效率,并与两种传统的文库构建方法进行比较。实验结果显示,受微量DNA的限制,单链DNA环化建库对DNA初始量要求很高,故不能用于微量DNA建库;双链DNA环化建库法因其建库过程的低损耗而最终被采纳。通过探索滚环扩增对cf DNA中特异性位点的富集效率,及对低频突变的放大效果,最终发现,滚环扩增能够特异性扩增出目标片段,但在针对多个目标位点同时进行扩增时,受制于引物互作、Bst DNA聚合酶的跳跃性扩增及其高扩增效率等原因,无法准确扩增出全部的目标位点。但是滚环扩增针对单个位点的富集效率较高,在对不同比例的突变型内参与野生型内参的检测过程中,特异性引物可以靶向结合目标位点,并能够区分单碱基差异,经滚环扩增后,最终放大了突变型DNA在等位基因中的比例。通过与传统的多重PCR和连接法建库的比较,我们发现针对多个位点的特异性扩增时,多重PCR法能够很好地扩增出目的片段,而滚环扩增的富集效率较低。而针对单个位点中的低频突变,传统的连接法建库是非特异性扩增,不针对突变型内参,进而无法放大突变型内参与野生型的比例,而基于双链DNA环化建库的滚环扩增则能够在特异性引物针对性地结合到目标位点后,扩增突变型内参并放大其在等位基因中的比例。综上所述,滚环扩增技术对于微量cf DNA具有一定的富集能力,且能够放大ct DNA中低频突变在等位基因中的频率。

关键词：微量DNA cfDNA ctDNA 文库构建滚环扩增低频突变

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