微量DNA靶向富集新方法的研究

作     者：汪泽鑫 

作者单位：东南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：白云飞

授予年度：2020年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：微量DNA cfDNA ctDNA 文库构建 滚环扩增 低频突变 

摘      要：血浆游离DNA(cell free DNA,cf DNA)是体液中游离的、来源于人体细胞的片段化DNA,携带了人体基因信息和表观遗传信息等。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)则来源于肿瘤细胞,包含了肿瘤特有的基因信息和表观遗传信息,如单碱基突变,拷贝数变异及甲基化等。cf DNA作为液体活检的一项分子标志物,其无创、便捷的特性,在针对个体生理、病理状态等方面具有广阔的应用前景,尤其为肿瘤的诊断、预后、治疗及长期监测提供了重要依据。然而,当前针对ct DNA中变异有限的检测准确度限制了其在临床上的大规模应用,主要是单位体积全血中包含的cf DNA量少,ct DNA的突变频率低,且二代测序的检测限为1%,满足不了对低频突变的准确检测。滚环扩增作为一种等温扩增技术,在具有链置换特性的聚合酶作用下,其始终以初始环DNA为模板进行扩增的特性,保证了每一轮扩增产生的错误不会传递给下一轮扩增,最终通过对产物的测序获得模板DNA的一致性序列。本实验将探索滚环扩增对微量cf DNA和低频突变的富集效率。本研究分为三个部分:(1)微量DNA的文库构建;(2)滚环扩增体系的探索;(3)滚环扩增技术对微量DNA的富集和低频突变检测能力的验证,及其与传统文库构建方法的比较。首先,我们通过连接法和多重PCR两种传统的文库构建方法对微量DNA进行建库,并通过双链DNA环化和单链DNA环化两种环DNA建库方法对微量DNA进行文库构建。接着,在具有链置换特性的DNA聚合酶和特定引物的介导下,对环DNA进行滚环扩增。最后,利用滚环扩增对微量DNA进行富集,并在cf DNA中设置了1:100和1:200两种突变频率的内参基因,以验证滚环扩增对cf DNA中低频突变的放大效率,并与两种传统的文库构建方法进行比较。实验结果显示,受微量DNA的限制,单链DNA环化建库对DNA初始量要求很高,故不能用于微量DNA建库;双链DNA环化建库法因其建库过程的低损耗而最终被采纳。通过探索滚环扩增对cf DNA中特异性位点的富集效率,及对低频突变的放大效果,最终发现,滚环扩增能够特异性扩增出目标片段,但在针对多个目标位点同时进行扩增时,受制于引物互作、Bst DNA聚合酶的跳跃性扩增及其高扩增效率等原因,无法准确扩增出全部的目标位点。但是滚环扩增针对单个位点的富集效率较高,在对不同比例的突变型内参与野生型内参的检测过程中,特异性引物可以靶向结合目标位点,并能够区分单碱基差异,经滚环扩增后,最终放大了突变型DNA在等位基因中的比例。通过与传统的多重PCR和连接法建库的比较,我们发现针对多个位点的特异性扩增时,多重PCR法能够很好地扩增出目的片段,而滚环扩增的富集效率较低。而针对单个位点中的低频突变,传统的连接法建库是非特异性扩增,不针对突变型内参,进而无法放大突变型内参与野生型的比例,而基于双链DNA环化建库的滚环扩增则能够在特异性引物针对性地结合到目标位点后,扩增突变型内参并放大其在等位基因中的比例。综上所述,滚环扩增技术对于微量cf DNA具有一定的富集能力,且能够放大ct DNA中低频突变在等位基因中的频率。