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伯氏疟原虫pbmag-1基因片段克隆及原核表达优化

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2007年第4期25卷 314-319页

作者：高宇辉王恒中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所病原系分子寄生虫学实验室北京100005

目的克隆并表达伯氏疟原虫pbmag-1基因cDNA片段。方法在GenBank中检索伯氏疟原虫编码基因pbmag-1部分cDNA序列,设计特异引物,经RT-PCR从伯氏疟原虫ANKA株扩增出该基因的部分cDNA片段。以锚定OligodT引物反转录mRNA获得的cDNA为模板,利... 详细信息

目的克隆并表达伯氏疟原虫pbmag-1基因cDNA片段。方法在GenBank中检索伯氏疟原虫编码基因pbmag-1部分cDNA序列,设计特异引物,经RT-PCR从伯氏疟原虫ANKA株扩增出该基因的部分cDNA片段。以锚定OligodT引物反转录mRNA获得的cDNA为模板,利用已知序列设计特异引物,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术延伸pbmag-13′端未知的编码序列,并将其克隆于原核表达载体后转入大肠埃希菌(***)BL21-(DE3)-RIL株,经优化诱导条件,表达了重组蛋白PbMAg-1并用其免疫小鼠。结果获得1341bp具有完整3′末端序列的pbmag-1基因片段,其A/T含量为73%。以包涵体形式表达的重组蛋白免疫小鼠,其血清抗体经蛋白质印迹(Western blotting)分析,能特异性地识别伯氏疟原虫感染红细胞相对分子质量约为Mr64000的蛋白。结论获得重组蛋白PbMAg-1的3′端完整的pbmag-1基因cDNA片段,为研究伯氏疟原虫PbMAg-1蛋白在鼠疟免疫反应中的作用奠定了实验基础。

关键词： pbmag-1 伯氏疟原虫基因克隆原核表达

伯氏疟原虫红内期融合抗原的构建、表达及其免疫原性研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2008年第5期26卷 327-331页

作者：曹毅张冬梅潘卫庆第二军医大学病原生物学教研室上海200433

目的合成伯氏疟原虫红内期融合抗原基因PbCP-2.9,在毕赤酵母真核系统中表达其产物,并进行免疫原性分析。方法选取与恶性疟原虫红内期融合抗原基因PfCP-2.9具有同源性的伯氏疟原虫AMA1(Ⅲ)和MSP1-19序列,融合形成PbCP-2.9基因。基因序列... 详细信息

目的合成伯氏疟原虫红内期融合抗原基因PbCP-2.9,在毕赤酵母真核系统中表达其产物,并进行免疫原性分析。方法选取与恶性疟原虫红内期融合抗原基因PfCP-2.9具有同源性的伯氏疟原虫AMA1(Ⅲ)和MSP1-19序列,融合形成PbCP-2.9基因。基因序列经密码子优化,在毕赤酵母中分泌表达。60只BABL/c小鼠均分为6组,其中蛋白免疫组3组,分别用PbCP-2.9蛋白与福氏佐剂、ISA206和IMS1312佐剂乳化后,皮下注射免疫小鼠,抗原免疫剂量20μg/只·次,注射体积200μl,共免疫3次,每次间隔2周。佐剂对照组3组,以PBS代替免疫抗原同法免疫。免疫前及每次免疫后1周鼠尾取血,分离血清。用ELISA和IFAT方法检测血清中特异性抗体的滴度及其与天然抗原的反应结果。结果PbCP-2.9基因在毕赤酵母中分泌表达出Mr约26400的PbCP-2.9蛋白,其与抗伯氏疟原虫红内期原虫的血清能进行特异性反应;ELISA检测PbCP-2.9蛋白免疫组结果表明,福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度为(52.62±11.26),第3次免疫后为(94.50±52.84);ISA206组第2次免疫后为(7.59±5.61),第3次免疫后为(25.60±16.92);IMS1312组第2次免疫后为(9.41±8.86),第3次免疫后为(28.92±12.98)。福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度分别为ISA206组的6.9和IMS1312组的5.6倍(F=81.06,P伯氏疟原虫天然抗原。

关键词：伯氏疟原虫红内期融合抗原基因表达免疫原性

伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库构建

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2004年第3期22卷 139-143页

作者：贝祝春王京燕军事医学科学院微生物与流行病研究所北京100071

目的　构建伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。　方法　提取伯氏疟原虫K173株 (NS)与青蒿素抗性株 (AR)的总RNA ,superSMART法合成双链cDNA ,分别以NS为消减方 (driver) ,AR为试验方 (tester)及AR为driver ,AS为tester进行双向... 详细信息

目的　构建伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。　方法　提取伯氏疟原虫K173株 (NS)与青蒿素抗性株 (AR)的总RNA ,superSMART法合成双链cDNA ,分别以NS为消减方 (driver) ,AR为试验方 (tester)及AR为driver ,AS为tester进行双向抑制性消减PCR(SSHPCR)。富集的差异表达cDNA克隆到pMD18 T载体构建消减文库。　结果　NS AR和AR NS消减文库分别获得 3 95个和 5 0 6个阳性克隆 ,从NS AR和AR NS文库中随机挑取 10 8个克隆PCR鉴定 ,分别有 10 0个和 10 4个含插入片段 ,大小在 0 .2 5～ 2kb之间。　结论　成功构建了伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。

关键词：伯氏疟原虫青蒿素抗性 cDNA文库 PCR 基因文库

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伯氏疟原虫红外期体外培养的研究

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1991年第1期9卷 28-30页

作者：严汉英杨彬潘伟娜刘学丽南京药物研究所药理室

本文报告在国内首次建成了胚肺细胞-伯氏疟原虫红外期体外培养系统.用胰酶消化法自人工流产胎儿分离出胚肺细胞后,建立Elu 8801细胞株。斯氏按蚊叮咬伯氏疟原虫ANKA株感染的昆明小鼠18～21d后,在无菌条件下解剖出唾腺,制备子孢子悬液,... 详细信息

本文报告在国内首次建成了胚肺细胞-伯氏疟原虫红外期体外培养系统.用胰酶消化法自人工流产胎儿分离出胚肺细胞后,建立Elu 8801细胞株。斯氏按蚊叮咬伯氏疟原虫ANKA株感染的昆明小鼠18～21d后,在无菌条件下解剖出唾腺,制备子孢子悬液,接种于单层培养的胚肺细胞。培养48h后,可见红外期裂殖体。72h后,部分裂殖体内已形成成熟的裂殖子,将培养上清经腹腔接种健康小鼠,可使之感染疟疾并可经血传感染其它小鼠。用第2代感染小鼠血饲喂按蚊,蚊体内可产生子孢子。表明本室建立的人胚肺细胞林对***株易感染,并能支持其红外期发育成熟,产生有感染力的红外期裂殖子。

关键词：伯氏疟原虫红外期体外培养

伯氏疟原虫ANKA株抗哌喹系小鼠模型免疫学分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2012年第1期30卷 12-16,19页

作者：黄宪希周利民易国辉吴金燕潘在用薛伟玲郭虹海南医学院科学实验中心海口571101

目的观察伯氏疟原虫（Plasmodium berghei，Pb）ANKA抗哌喹（PQR）系小鼠模型的免疫学特征。方法64只昆明小鼠随机分为3组，A组和C组各16只，B组32只（其中16只用于观察存活天数）。A组和B组小鼠分别经腹腔感染伯氏疟原虫ANKA株哌喹敏... 详细信息

目的观察伯氏疟原虫（Plasmodium berghei，Pb）ANKA抗哌喹（PQR）系小鼠模型的免疫学特征。方法64只昆明小鼠随机分为3组，A组和C组各16只，B组32只（其中16只用于观察存活天数）。A组和B组小鼠分别经腹腔感染伯氏疟原虫ANKA株哌喹敏感系（PbPQS）和抗性系（PbPQR）红内期原虫1×10^7个（200μl血），C组（健康对照组）注射等量生理盐水。每组于感染后4、8、12和16d各取4只小鼠，取尾血制薄血膜镜检，计算红细胞原虫感染率（简称原虫率）。脱颈处死小鼠，无菌取脾制备脾淋巴细胞悬液，用CCK-8法测定各组小鼠脾淋巴细胞经刀豆球蛋白A（ConA）刺激后的增殖反应，用Griess法和ELISA分别测定脾淋巴细胞培养上清中NO含量和γ干扰素（IFN-γ）水平。另取10只昆明小鼠，每鼠腹腔接种PbPQR系原虫约1×10^7个，待原虫率上升后下降，典型的原虫转变为蓝染细胞时，腹腔感染PbPQS系原虫（1×10^6个）进行攻击感染，观察小鼠原虫率和小鼠存活情况。结果A组小鼠平均存活（9．0＋3．0）d，感染后6～12d原虫率均〉50％，出现严重贫血。感染后16d，B组小鼠全部存活，原虫率为（26．66±2．54）％。A、B两组小鼠的脾淋巴细胞经ConA刺激后增殖显著，感染后12d，分别为0．65±0．08和0．86±0．20（P〈0．01）。脾淋巴细胞培养上清中，NO含量随感染时间延长而上升，感染后12d，A、B和C组分别为（48．80±3．49）、（54．80±2．17）和（7．80±0．71）μmol／L，三者比较差异有统计学意义（P〈0．01）。A组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平随感染时间延长而上升，感染后12d达到最高，为（752．20±39．49）pg／ml，B组于感染后8d升至峰值[（855．80±33．65）pg／ml]，感染后12d降至（620．20±27．11）pg／ml；感染后8d和12d，A组和B组IFN．吖水平的差异有统计学意义（P〈0．01）。用PbPQS系攻击感染PbPQR系小鼠模型后10d，原虫率为（2．44±2．07）％，随之逐渐消失，感染后40d未检出虫体，无小鼠死亡。结论伯氏疟原虫ANKA株哌喹抗性系感染小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、NO水平和IFN-γ含量均显著高于PbANKA株PQS系感染小鼠，可诱导小鼠产生一定保护性免疫反应。

关键词：伯氏疟原虫哌喹抗性免疫

伯氏疟原虫推测分泌动合子蛋白7截短片段传播阻断功能的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2019年第5期37卷 520-524,531页

作者：郑文琪王俊瑞王华刘飞罗恩杰曹雅明韩艳秋内蒙古医科大学附属医院临床检验中心呼和浩特010050 内蒙古医科大学基础医学院寄生虫学教研室呼和浩特010050 中国医科大学基础医学院免疫学教研室沈阳110021 中国医科大学基础医学院病原生物学教研室沈阳110021

目的通过体外阻断实验与蚊虫直接喂养实验对截短的重组伯氏疟原虫推测分泌动合子蛋白7(rPbPSOP7)31~210氨基酸(aa)片段的传播阻断能力进行研究。方法体外阻断实验,雌性BALB/c小鼠经腹腔注射5×106伯氏疟原虫感染红细胞(PbRBC),感染后第3... 详细信息

目的通过体外阻断实验与蚊虫直接喂养实验对截短的重组伯氏疟原虫推测分泌动合子蛋白7(rPbPSOP7)31~210氨基酸(aa)片段的传播阻断能力进行研究。方法体外阻断实验,雌性BALB/c小鼠经腹腔注射5×106伯氏疟原虫感染红细胞(PbRBC),感染后第3天,尾静脉收集血液,与rPbPSOP7免疫小鼠血清(大肠埃希菌表达并纯化,与弗氏佐剂混合后免疫BALB/c小鼠)进行混合培养,观察不同稀释倍数(1:5、1:10、1:50)免疫血清培养15 min后疟原虫配子体出丝数及培养24 h后动合子形成数的变化,以同样稀释倍数的His标签蛋白免疫血清为对照。蚊虫直接喂养实验,rPbPSOP7(实验组)或His标签蛋白(对照组)与弗氏佐剂混合后各免疫5只雌性BALB/c小鼠,于末次免疫后第10天,用苯肼处理并经腹腔注射5×10^6PbRBC,感染后第3天,每组小鼠用至少50只雌性按蚊直接吸食小鼠血液,吸血后第10天解剖按蚊,计数蚊胃壁上的囊合子数,计算蚊虫感染率。实验重复3次。结果体外阻断实验中,与His标签蛋白免疫血清对照组相比,rPbPSOP7免疫血清1:5、1:10和1:50稀释培养的配子体出丝数分别减少了22.0%、8.0%和2.0%,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,培养24 h后,1:5、1:10与1:50稀释培养的动合子形成数分别减少了69.2%、56.4%和48.6%(P0.05)。结论rPbPSOP7免疫血清可明显减少动合子及囊合子的形成,抗rPbPSOP7血清具有一定的传播阻断能力。

关键词：伯氏疟原虫传播阻断疫苗候选抗原推测分泌动合子蛋白7

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伯氏疟原虫的体外培养和扫描电镜观察

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1990年第2期8卷 121-123页

作者：严继舟苏天成湖北医学院寄生虫学教研室

采用蜡烛缸法比较大鼠血清、人脐带血清、成人B型血清、兔血清、小牛血清和加有次黄嘌呤的小牛血清对伯氏疟原虫体外生长的影响.并对培养前和培养12、20、28h的小牛血清培养物作扫描电镜观察。结果表明,所用血清均不能明显改善长期培养... 详细信息

采用蜡烛缸法比较大鼠血清、人脐带血清、成人B型血清、兔血清、小牛血清和加有次黄嘌呤的小牛血清对伯氏疟原虫体外生长的影响.并对培养前和培养12、20、28h的小牛血清培养物作扫描电镜观察。结果表明,所用血清均不能明显改善长期培养效果;对短期培养的效果,以大鼠血清和人脐带血清为优,次黄嘌呤对疟原虫体外生长有潜在的抑制作用。电镜观察表明,小牛血清能使大鼠红细胞发生凝集,红细胞和疟原虫表面所形成的表面粘附物能妨碍裂殖子入侵和疟原虫对代谢物的吸收和排泄。

关键词：伯氏疟原虫体外培养扫描电镜

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伯氏疟原虫青蒿素抗性系的培育研究

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2002年第1期20卷 37-38页

作者：陈颖丹林宝英张家埙中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

目的　培育伯氏疟原虫青蒿素抗性系。　方法与结果　采用伯氏疟原虫接种传代和青蒿素剂量递增法分3条路线进行培育 :A线 ,青蒿素起始剂量为 12 6 .2 mg/kg(相当于 1/2 ED50 ) ,递增剂量为 6 0 mg/kg,每隔 2代改为12 6 .2 mg/kg加强 1次... 详细信息

目的　培育伯氏疟原虫青蒿素抗性系。　方法与结果　采用伯氏疟原虫接种传代和青蒿素剂量递增法分3条路线进行培育 :A线 ,青蒿素起始剂量为 12 6 .2 mg/kg(相当于 1/2 ED50 ) ,递增剂量为 6 0 mg/kg,每隔 2代改为12 6 .2 mg/kg加强 1次。第 14、30、4 4及第 6 0代抗性指数 (I50 )逐渐上升 ,分别为 4 .0 1、10 .11、16 .0 2及 18.93;至第76代 ,抗性减弱 ,I50 为 14 .89;至第 10 8代 ,剂量达 886 2 .5 mg/kg,I50 仅为 10 .4 9。B线 ,是从 A线第 6 6代转种而来 ,此后每周给药 1次 ,剂量为 4 0 0 0 mg/kg,至第 4 0代 I50 为 2 7.4 5 ,抗药性明显增强。C线 ,是从 B线第 19代转种而来 ,此后每周给药 1次 ,剂量为 2 0 0 0 mg/kg,至第 15代 ,I50 为 17.4 1。

关键词：伯氏疟原虫青蒿素抗药性培育研究

伯氏疟原虫对小鼠脾B细胞和自然杀伤细胞及其表面分子的影响

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2020年第2期38卷 255-258页

作者：张杰森张梦欣韩孟伊陈冰霞李勇森金晨曦齐艳伟广州医科大学第三临床学院广州511436 广州医科大学病原生物学与免疫学教研室广州511436

为探讨伯氏疟原虫对小鼠脾B细胞和自然杀伤(NK)细胞及其表面分子的影响,将10只雌性C57BL/6小鼠随机分为健康对照组和感染组,每组5只。感染组小鼠经尾静脉注射伯氏疟原虫(106个/鼠)进行感染,健康对照组注射等量生理盐水。感染后6 d,取小... 详细信息

为探讨伯氏疟原虫对小鼠脾B细胞和自然杀伤(NK)细胞及其表面分子的影响,将10只雌性C57BL/6小鼠随机分为健康对照组和感染组,每组5只。感染组小鼠经尾静脉注射伯氏疟原虫(106个/鼠)进行感染,健康对照组注射等量生理盐水。感染后6 d,取小鼠脾,制备单细胞悬液,采用流式细胞术检测小鼠B细胞和NK细胞的含量及其表面分子CD62L、CXCR3、CD69的表达水平。结果显示,感染组小鼠脾B细胞百分比含量为(79.2±3.6)%,高于健康对照组的(54.3±4.4)%(P0.05);CD62L在感染组NK细胞中的百分比为(61.9±4.8)%,低于健康对照组的(86.6±4.2)%(P0.05)。CD69在感染组B细胞和NK细胞中的百分比分别为(54.3±4.7)%、(22.2±1.6)%,均高于健康对照组的(1.9±0.4)%、(1.3±0.3)%(P疟原虫的小鼠可能通过增加B细胞的数量以及上调其表面分子CXCR3和CD69及NK细胞表面分子CD69的表达水平发挥抗疟作用。

关键词：伯氏疟原虫脾脏免疫细胞细胞表面分子