检索结果-南通市图书馆

作者：程相锦华中农业大学

学位级别：硕士

1-脱氧野尻霉素(简称DNJ)是一种多羟基哌啶类生物碱,具有强效的α-葡萄糖苷酶抑制活性,是一种潜在的医治糖尿病的药物。DNJ来源广泛,因微生物生长繁殖快,易于培养,且容易通过菌种改良,发酵工艺优化等方法来提高产量,微生物合成DNJ得到... 详细信息

1-脱氧野尻霉素(简称DNJ)是一种多羟基哌啶类生物碱,具有强效的α-葡萄糖苷酶抑制活性,是一种潜在的医治糖尿病的药物。DNJ来源广泛,因微生物生长繁殖快,易于培养,且容易通过菌种改良,发酵工艺优化等方法来提高产量,微生物合成DNJ得到越来越多科研工作者的关注,但目前微生物合成DNJ的产量仍相对较低,限制了应用。本研究以Bacillus amyloliquefaciens HZ-12为出发菌株,围绕DNJ合成和葡萄糖转运途径,构建高产DNJ的工程菌,并在摇瓶上优化了工程菌的培养基和培养条件。本研究以*** HZ-12为研究对象,强化表达DNJ合成途径中关键基因gab T1、ykt C1和gut B1。首先构建游离过表达工程菌HZ-12/p HY-gab T1、HZ-12/p HY-ykt C1和HZ-12/p HY-gut B1,发现其DNJ含量均明显高于空质粒菌株,而与野生菌HZ-12相比提高并不明显。进而将基因gab T1、ykt C1和gut B1分别整合到HZ-12基因组,得到整合表达工程菌HZ-12ΔXkd G::gab T1、HZ-12ΔXkd E::ykt C1和HZ-12ΔXtm A::gut B1,发现其DNJ含量均有显著提高,与野生菌HZ-12相比,其DNJ含量分别提高了19.1%、13.4%和16.7%。本研究对葡萄糖转运途径进行代谢工程改造。首先分别敲除基因glc P1、glc U和pts G构建缺失菌株HZ-12△glc P1,HZ-12△glc U和HZ-12△pts G,发现缺失菌株的DNJ含量均大幅度下降。进而构建游离过表达工程菌HZ-12/p HY-glc P1、HZ-12/p HY-glc U和HZ-12/p HY-pts G,结果发现其DNJ含量均高于空质粒菌株,其中glcp1的强化表达使菌株DNJ含量提高最为明显,相比于野生菌HZ-12提高了19.5%,而glc U、pts G强化表达使菌株DNJ含量虽高于空质粒菌株,但仍低于HZ-12。为进一步提高DNJ含量,本研究构建了三株多基因整合表达工程菌HZ-12/TB(基因gab T1和gut B1同时整合到HZ-12基因组)、HZ-12/TCB(gab T1、ykt C1和gut B1同时整合到HZ-12基因组)和HZ-12/TBP(基因gab T1、gut B1和glc P1同时整合到HZ-12基因组),发现其DNJ含量均有提高。而工程菌HZ-12/TCB的DNJ含量提高最为明显,相比于野生菌HZ-12提高了32.3%。在摇瓶上优化了工程菌HZ-12/TBP发酵合成DNJ的液体发酵工艺,优化后的发酵培养基为(g/L):麦芽浸粉70,可溶性淀粉30,KHPO·3HO 1.0,Mg SO·7HO0.2,Fe SO·7HO 0.075,Mn SO·HO 0.075。优化后的发酵条件为:培养温度37°C,种龄9h,接种量为2%,装液量为30 m L/250 m L,初始p H为7.5。在此优化条件下,HZ-12/TBP的DNJ含量达到315.2mg/L,与初始液体培养基相比提高了88.4%,同时较野生菌HZ-12提高了26.8%。此外,通过在黄豆固体培养基中添加2%乳糖和1%麦芽浸粉,HZ-12/TBP在固体发酵培养基中的DNJ含量高达1135.6mg/kg,相比于初始固体培养基提高了19.3%,显著提高了DNJ的含量。

关键词： 1-脱氧野尻霉素解淀粉芽胞杆菌代谢工程育种葡萄糖转运发酵工艺

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代谢工程改造解淀粉芽胞杆菌高产1-脱氧野尻霉素

代谢工程改造解淀粉芽胞杆菌高产1-脱氧野尻霉素

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作者：芦玉华中农业大学

学位级别：硕士

1-脱氧野尻霉素(简称DNJ)是一类对a-葡萄糖苷酶有较强抑制性的生物碱,具有降血糖血脂、抗病毒、抗炎症等药效,其衍生物米格列醇已被用作Ⅱ型糖尿病的临床药物。微生物来源的DNJ降血糖效果较好且具有安全性,此外具有生产成本低、生产周... 详细信息

1-脱氧野尻霉素(简称DNJ)是一类对a-葡萄糖苷酶有较强抑制性的生物碱,具有降血糖血脂、抗病毒、抗炎症等药效,其衍生物米格列醇已被用作Ⅱ型糖尿病的临床药物。微生物来源的DNJ降血糖效果较好且具有安全性,此外具有生产成本低、生产周期短等优势,已成为当前研究热点。目前,微生物高效合成DNJ主要着眼于菌株选育和培养基优化,其产量较低限制了DNJ的进一步应用。本研究以本实验室筛选到的一株产DNJ的解淀粉芽胞杆菌HZ-12为出发菌株,借助代谢工程育种的方法构建了高产DNJ的工程菌株。本文从以下四个方面分别进行了探究:1.探究碳调控因子CcpC、CcpN对DNJ合成的影响。2.L-葡萄糖是DNJ合成的底物,优化葡萄糖的转运途径,实现葡萄糖的高效供给,促进DNJ高效合成。3.增强前体物供应:L-葡萄糖进入胞内后被转化为6-磷酸果糖(F-6-P),为DNJ的合成提供碳骨架。L-谷氨酸是DNJ合成所需的氨基供体。增强F-6-P、L-谷氨酸供应,促进DNJ高产。4.优化DNJ合成酶基因簇的启动子,促进DNJ合成酶基因簇的表达,进一步提高DNJ产量。首先,本研究分别构建了碳调控因子CcpC、CcpN的单基因缺失菌株,并完成DNJ发酵。试验结果显示,ccpC单基因缺失菌HZΔccpC的DNJ产量达到284.16 mg/L,相对于原始菌株HZ-12(228.03 mg/L)提高了 24.61%,并且研究发现缺失ccpC可促进菌体生长。而ccpN缺失菌株HZΔccpN的DNJ产量相对于对照菌株HZ-12降低了32.72%。随后,在优化葡萄糖转运途径方面,本研究削弱了解淀粉芽胞杆菌HZ-12中依赖磷酸烯醇式丙酮酸的葡萄糖转运途径(PTS),并以此为基础强化非PTS途径(NPTS),成功构建优化葡萄糖转运途径的工程菌HZAptsG/pHY-glcP,该菌株DNJ产量相对于原始菌株HZ-12提高了 20.83%,并且相对于HZ/pHY-glcP提高了 12.93%。此外,HZΔptsG/pHY-glcP副产物的总量相对于原始菌株HZ-12下降了 8.66%。由此说明,优化葡萄糖转运途径可以减少副产物乙酸、乙偶姻和2,3-丁二醇的产生,促进了 DNJ合成。芽胞杆菌胞内的F-6-P参与多个代谢反应,如EMP途径、糖异生途径、肽聚糖合成、DNJ合成等。为了能使更多的F-6-P进入DNJ合成过程中,本研究对解淀粉芽胞杆菌的F-6-P代谢节点改造。在菌株HZΔccpC基础上,通过替换强启动子PbacA来强化糖异生途径的果糖1,6-二磷酸酶基因glpX和糖酵解途径的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi,从而构建了工程菌HZΔccpC-PbacA-glpX、HZΔccpC-PbacA-pgi。发酵结果表明,上述菌株DNJ的产量分别达到319.10 mg/L、304.10 mg/L,相比对照菌株HZΔccpC分别提高了 12.25%、6.98%。与此同时,在HZ-12基础上敲除了肽聚糖合成相关的调控因子基因nanR,构建了 HZΔnanR菌株,其DNJ产量相对于原始菌株HZ-12提高了 14.11%。外源添加L-谷氨酸可以提高HZΔccpC的DNJ合成水平,当在发酵36 h时添加1.5 g/LL-谷氨酸,DNJ产量相比对照提高2.34倍。最后,本研究选用了实验室已有的不同类型的强启动子(PbacA、PykzA、P43、RBS6和R5),构建了不同启动子介导的DNJ合成酶基因簇强化菌株HZΔccpC/pHY-PbacA-TYB、HZΔccpC/pHY-PykzA-TYB、HZΔccpC/pHY-P43-TYB、HZΔccpC/pHY-RBS6-TYB 和 HZΔccpC/pHY-R5-TYB。其中启动子 P43、RBS6以及R5所对应的DNJ合成基因簇TYB强化菌株的DNJ产量相对于对照菌株提高显著。HZΔccpC/pHY-P43-TYB、HZΔccpC/pHY-RBS6-TYB 和HZΔccpC/pHY-R5-TYB 的 DNJ 产量分别达到 461.14mg/L、503.57 mg/L 和 512.50 mg/L,相对于对照菌株HZΔccpC/pHY300分别提高了 170.63%、195.53%和200.77%。随后进一步探究HZΔccpC/pHY-R5-TYB菌株的DNJ合成能力,在发酵至36 h时添加L-谷氨酸,DNJ产量提高至1210.70 mg/L,为目前报道的芽胞杆菌中DNJ的最高产量。本研究通过代谢育种构建出一株高产DNJ的***工程菌株,为微生物大规模制备DNJ及其衍生物奠定基础。此外,可为微生物高产其他α-葡萄糖苷酶制剂提供参考和借鉴。

关键词： 1-脱氧野尻霉素解淀粉芽胞杆菌代谢工程育种碳调控因子葡萄糖转运 1-脱氧野尻霉素合成酶基因簇

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氨基酸产业现状及生产菌株选育技术

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发酵科技通讯 2018年第2期47卷 110-114页

作者：关丹李燕军陈宁中国生物发酵产业协会北京100833 莲花健康产业集团股份有限公司博士后科研工作站河南项城466200 天津科技大学生物工程学院天津300457

综述了2017年我国氨基酸产能、产量及出口情况,系统介绍了氨基酸生产菌株选育技术.常规育种技术尚不过时,其应与反向代谢工程研究相结合.代谢工程育种技术经过多年的发展,已经取得了长足的进步,从常规代谢工程发展为系统代谢工程,同时... 详细信息

综述了2017年我国氨基酸产能、产量及出口情况,系统介绍了氨基酸生产菌株选育技术.常规育种技术尚不过时,其应与反向代谢工程研究相结合.代谢工程育种技术经过多年的发展,已经取得了长足的进步,从常规代谢工程发展为系统代谢工程,同时进化代谢工程也展现出巨大的应用价值.工业化菌株构建需在基因组水平操作,介绍了氨基酸生产菌种大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌基因组编辑技术的现状.最后,简要介绍了精确代谢调控技术,包括基因表达的强化和弱化策略,并给出了应用实例.

关键词：氨基酸常规育种代谢工程育种基因组编辑精确代谢调控

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