代谢工程改造解淀粉芽胞杆菌高产1-脱氧野尻霉素

作     者：芦玉 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冀志霞

授予年度：2020年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 10[医学] 

主      题：1-脱氧野尻霉素 解淀粉芽胞杆菌 代谢工程育种 碳调控因子 葡萄糖转运 1-脱氧野尻霉素合成酶基因簇 

摘      要：1-脱氧野尻霉素(简称DNJ)是一类对a-葡萄糖苷酶有较强抑制性的生物碱,具有降血糖血脂、抗病毒、抗炎症等药效,其衍生物米格列醇已被用作Ⅱ型糖尿病的临床药物。微生物来源的DNJ降血糖效果较好且具有安全性,此外具有生产成本低、生产周期短等优势,已成为当前研究热点。目前,微生物高效合成DNJ主要着眼于菌株选育和培养基优化,其产量较低限制了DNJ的进一步应用。本研究以本实验室筛选到的一株产DNJ的解淀粉芽胞杆菌HZ-12为出发菌株,借助代谢工程育种的方法构建了高产DNJ的工程菌株。本文从以下四个方面分别进行了探究:1.探究碳调控因子CcpC、CcpN对DNJ合成的影响。2.L-葡萄糖是DNJ合成的底物,优化葡萄糖的转运途径,实现葡萄糖的高效供给,促进DNJ高效合成。3.增强前体物供应:L-葡萄糖进入胞内后被转化为6-磷酸果糖(F-6-P),为DNJ的合成提供碳骨架。L-谷氨酸是DNJ合成所需的氨基供体。增强F-6-P、L-谷氨酸供应,促进DNJ高产。4.优化DNJ合成酶基因簇的启动子,促进DNJ合成酶基因簇的表达,进一步提高DNJ产量。首先,本研究分别构建了碳调控因子CcpC、CcpN的单基因缺失菌株,并完成DNJ发酵。试验结果显示,ccpC单基因缺失菌HZΔccpC的DNJ产量达到284.16 mg/L,相对于原始菌株HZ-12(228.03 mg/L)提高了 24.61%,并且研究发现缺失ccpC可促进菌体生长。而ccpN缺失菌株HZΔccpN的DNJ产量相对于对照菌株HZ-12降低了32.72%。随后,在优化葡萄糖转运途径方面,本研究削弱了解淀粉芽胞杆菌HZ-12中依赖磷酸烯醇式丙酮酸的葡萄糖转运途径(PTS),并以此为基础强化非PTS途径(NPTS),成功构建优化葡萄糖转运途径的工程菌HZAptsG/pHY-glcP,该菌株DNJ产量相对于原始菌株HZ-12提高了 20.83%,并且相对于HZ/pHY-glcP提高了 12.93%。此外,HZΔptsG/pHY-glcP副产物的总量相对于原始菌株HZ-12下降了 8.66%。由此说明,优化葡萄糖转运途径可以减少副产物乙酸、乙偶姻和2,3-丁二醇的产生,促进了 DNJ合成。芽胞杆菌胞内的F-6-P参与多个代谢反应,如EMP途径、糖异生途径、肽聚糖合成、DNJ合成等。为了能使更多的F-6-P进入DNJ合成过程中,本研究对解淀粉芽胞杆菌的F-6-P代谢节点改造。在菌株HZΔccpC基础上,通过替换强启动子PbacA来强化糖异生途径的果糖1,6-二磷酸酶基因glpX和糖酵解途径的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi,从而构建了工程菌HZΔccpC-PbacA-glpX、HZΔccpC-PbacA-pgi。发酵结果表明,上述菌株DNJ的产量分别达到319.10 mg/L、304.10 mg/L,相比对照菌株HZΔccpC分别提高了 12.25%、6.98%。与此同时,在HZ-12基础上敲除了肽聚糖合成相关的调控因子基因nanR,构建了 HZΔnanR菌株,其DNJ产量相对于原始菌株HZ-12提高了 14.11%。外源添加L-谷氨酸可以提高HZΔccpC的DNJ合成水平,当在发酵36 h时添加1.5 g/LL-谷氨酸,DNJ产量相比对照提高2.34倍。最后,本研究选用了实验室已有的不同类型的强启动子(PbacA、PykzA、P43、RBS6和R5),构建了不同启动子介导的DNJ合成酶基因簇强化菌株HZΔccpC/pHY-PbacA-TYB、HZΔccpC/pHY-PykzA-TYB、HZΔccpC/pHY-P43-TYB、HZΔccpC/pHY-RBS6-TYB 和 HZΔccpC/pHY-R5-TYB。其中启动子 P43、RBS6以及R5所对应的DNJ合成基因簇TYB强化菌株的DNJ产量相对于对照菌株提高显著。HZΔccpC/pHY-P43-TYB、HZΔccpC/pHY-RBS6-TYB 和HZΔccpC/pHY-R5-TYB 的 DNJ 产量分别达到 461.14mg/L、503.57 mg/L 和 512.50 mg/L,相对于对照菌株HZΔccpC/pHY300分别提高了 170.63%、195.53%和200.77%。随后进一步探究HZΔccpC/pHY-R5-TYB菌株的DNJ合成能力,在发酵至36 h时添加L-谷氨酸,DNJ产量提高至1210.70 mg/L,为目前报道的芽胞杆菌中DNJ的最高产量。本研究通过代谢育种构建出一株高产DNJ的***工程菌株,为微生物大规模制备DNJ及其衍生物奠定基础。此外,可为微生物高产其他α-葡萄糖苷酶制剂提供参考和借鉴。