检索结果-南通市图书馆

作者：邹儒雅河北医科大学

学位级别：硕士

目的:药物影响心肌细胞的离子通道,会使动作电位复极化时程延长,在心电图(ECG)上表现为QT间期延长,易诱发早后除极(EAD),增加室性心动过速的风险进而可能引发心性猝死,是新药研发失败和上市后药物撤市的重要原因。因此,检测新化学实体(N... 详细信息

目的:药物影响心肌细胞的离子通道,会使动作电位复极化时程延长,在心电图(ECG)上表现为QT间期延长,易诱发早后除极(EAD),增加室性心动过速的风险进而可能引发心性猝死,是新药研发失败和上市后药物撤市的重要原因。因此,检测新化学实体(NCE)对心肌细胞离子通道的影响,评估其潜在的致心律失常风险是新药研发早期安全性筛查的必要内容。近年来研究表明,人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)具有与成年人心肌细胞比较相似的电生理特征,可以解决动物心肌细胞电生理与人类相差很大的种属问题,而且与异源表达细胞系相比,hiPSC-CMs对药物反应更加敏感。因此,近年美国食品药品监督管理局(FDA)联合健康与环境科学研究所(HESI)等国际组织提出了“药物致心律失常体外综合评价(简称CiPA)”这一新模式,而采用hiPSC-CMs在细胞水平直接检测药物致心律失常的风险是其中重要的一部分,可望成为早期心脏安全性筛查的新策略。目前,国内没有国际通用的商业化hiPSC-CMs,只有少数公司在研发hiPSC-CMs,基于该细胞的电生理指标的评价体系尚未见报道。为此,本课题拟利用hiPSC-CMs建立药物致心律失常风险筛查技术平台,有望在新药研发过程中及早发现新药潜在的致命性不良反应,从而合理评估药物的研发前景,这对创新药物的研发具有十分重要的意义。方法:1.免疫荧光染色:对day 7的细胞进行cTNT和α-actin的免疫荧光染色,在共聚焦显微镜下进行扫描,通过荧光表达情况,对hiPSC-CMs进行验证。***-PCR:使用微量样品总RNA提取试剂盒对hiPSC-CMs的RNA进行提取,逆转录为cDNA后,经RT-PCR检测hERG、KCNQ1、KCNE1、Nav1.5和Cav1.2的mRNA表达情况。3.全自动心肌细胞多功能检测平台(CardioExcyte 96,德国Nanion Technologies)检测:将hiPSC-CMs按照供应商提供的步骤进行复苏,用纤维连结蛋白包被专用96孔电极板(型号:NSP96-0.6)后,将用台盼蓝染色计数后的细胞悬液以3.0万/孔接种到电极板中。对细胞的base imp(代表细胞贴壁程度)、BR(搏动频率)和FPDc(max)(BR校正后的场电位时程)等主要参数每隔3 h监测一次,持续监测至上述参数达到稳定。稳定后加入高、中、低三种风险药物共12种(由FDA推荐),每种药物设高、中、低三个浓度,每个浓度设三个复孔,在加药后连续监测24 h(前2 h内每5 min监测一次,之后每1 h监测一次),观察药物对hiPSC-CMs场电位的影响并进行计算和统计。结果:***-CMs的验证:在倒置显微镜下观察day 2和day 7细胞,可发现细胞贴壁变大呈梭形,均匀分布在培养皿中形成了单细胞层,并开始同步搏动;通过对day 7细胞荧光染色后,在共聚焦显微镜下可以观察到心肌特异性标志物cTNT和α-actin的荧光;RT-PCR结果显示,对day 1和day 7细胞的RT-PCR验证,包括hERG、KCNQ1、KCNE1、Nav1.5以及Cav1.2等离子通道在mRNA水平均有表达。综合以上结果可判定诱导分化的细胞为心肌细胞。2.场电位背景数据:在hiPSC-CMs复苏7天后,场电位的各项参数(base imp、BR和FPDc(max))均达到稳定,可以进行后续给药;稳定后的hiPSC-CMs的基本参数BR为60-80/min,FPDc(max)为0.1-0.4 s,与国外文献报道基本一致。3.药物诱发心律失常的情况:实验中可发现药物诱发早后除极和触发电活动(TA)的心律失常现象,后者表现为震荡性除极和不规则搏动两种形式;在给药后出现连续三次以上任意一种上述类型波形都会判定为发生心律失常。高风险药物(苄普地尔、多非利特、奎尼丁、索他洛尔)在中、高浓度几乎全部会诱发心律失常现象,而中、低风险药物(氯丙嗪、西沙必利、特非那定、昂丹司琼、地尔硫卓、雷诺嗪、维拉帕米)中,除美西律外心律失常只见于高浓度。4.药物引发停跳现象:给药后出现超过3小时以上时间的停跳被记为出现停跳现象。高风险药物除索他洛尔外均易引发停跳现象;中风险药物在高浓度易引发停跳现象;低风险药物除美西律外几乎不会出现停跳现象。5.药物引发场电位改变:关于BR和FPDc(max)的统计则是采用自身比较法,将给药后2 h内和24 h内稳定后的数值与给药前的数值进行比较,计算各孔参数的变化率。三类风险药物未见引发上述参数规律性的改变,亦无明显的浓度依赖性改变。6.与国际数据的比较:与国际其他机构的到的数据相比较大部分相符,有小部分数据有所出入。结论:国内商业化hiPSC-CMs对药物反应敏感,以是否出现心律失常现象来看,可区分开高风险药物和中低风险药

关键词：心律失常人诱导多能干细胞分化的心肌细胞综合性体外致心律失常评价 CardioExcyte96 场电位时程

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人诱导多能干细胞源性心肌细胞实时细胞评价系统评价药物心脏毒性方法的建立

人诱导多能干细胞源性心肌细胞实时细胞评价系统评价药物心脏毒性...

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作者：陈兴南京医科大学

学位级别：硕士

背景:生物工程和体外培养技术的进步导致了用于药物疗效/毒性测试[1]、疾病建模[2],以及心脏发育的力学研究[3-5]的心肌模型开发的迅速扩大。然而,这类技术的广泛应用是建立可靠的人类心肌细胞来源的基础上,这一技术被广泛应用于构建能... 详细信息

背景:生物工程和体外培养技术的进步导致了用于药物疗效/毒性测试[1]、疾病建模[2],以及心脏发育的力学研究[3-5]的心肌模型开发的迅速扩大。然而,这类技术的广泛应用是建立可靠的人类心肌细胞来源的基础上,这一技术被广泛应用于构建能够准确模拟活体组织的工程化的人类心脏结构。为此,科学家近年来致力于开发新型工程仿生心脏组织平台,以准确地再现人类心肌的结构和功能。在心脏工程领域,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)因为其来自于自身体细胞,故能够开发基于个体的医疗策略和特定患者的疾病模型,具备广阔的应用前景。迄今为止用于心脏建模的其他方法包括使用仙台病毒载体[6-8],该方法消除了与将转基因整合到宿主细胞基因组有关的翻译问题。此外,利用等体质粒[9-12]、microRNAs[13]和直接蛋白质传递[14-18]都被证明能够产生可分化为跳动的心肌细胞的ipSCs。对于在推进临床和基础科学研究中使用iPSC线的热情,人们对这些细胞是否与ESCs相同表示了关注。一方面,有人认为iPSCs和ESCs几乎相同,因为这两种细胞在体外表现出相似的表型、依赖性和行为[19-23]。此外,对大量克隆进行的分析表明,iPSC和ESC源在细胞特性方面存在相当大的重叠,因此,如果不进行深入测试,很难区分它们[24-28]。另一方面,微阵列研究表明,数百个基因以及DNA甲基化模式在iPSCs和ESCs之间存在差异表达[28-32]。总体而言,对iPSC和ESC系一系列特性的测量,包括基因表达、DNA甲基化、微RNA表达、分化倾向和胚胎中的互补活性,表明它们的特性确实不同[32-38]。虽然iPSC和ESC细胞之间存在着特定的差异,但是很少有确凿的证据表明,从这些细胞来源产生的心肌细胞一旦分化就会有任何有意义的区别。因此,尽管未分化干细胞来源有明显不同,iPSCs和ESC衍生心肌细胞之间具有高度的可比性,而且通常采用的心脏分化方法的重复性,再加上iPSCs在疾病建模和个性化医学应用方面的优势,使得iPSCs在临床和基础心脏研究应用中都具有广阔的应用前景。目的:建立适合于药物心脏毒性评价的人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CM)模型,并采用此模型评价化合物潜在的心脏毒性。方法:研究选用不同种类的心脏毒性药物:蒽环类抗癌药阿霉素(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10 μ mol·L-1)、Ⅲ类抗心律失常药物胺碘酮(10 nmol·L-1、100nmol.L-1、300 nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10μmol·L-1)、钙离子通道阻滞剂维拉帕米(10nmol·L-1、100nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10μmol·L-1),分别与hiPSC-CM孵育,采用实时细胞分析法实时监测心肌细胞搏动的频率、振幅、细胞指数、场电位时程等指标在给药前后的变化,建立人诱导多能干细胞分化的心肌细胞体外心脏毒性评价模型。结果:1.心肌细胞的纯度鉴定为了验证诱导多能干细胞源性心肌细胞实时细胞评价系统的精确性,采用流式细胞术的方法进行检测心肌细胞特征性蛋白肌钙蛋白(cardiac troponin T,cTnT)从而证明心肌细胞纯度达99%。形态学纯度鉴定指出分化的心肌细胞中肌钙蛋白含量较高。2.胺碘酮对hiPSC-CM相关指标的影响为了验证胺碘酮对hiPSC-CM相关指标的影响,我们检测了 hiPSC-CM的收缩力、收缩频率、增殖曲线和场电位时程(FPDc)。结果显示:hiPSC-CM搏动稳定后,给予不动浓度的胺碘酮(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、300 nmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1)后,结果显示,10nmol·L-1、100nmol·L-1、30 nmol·L-1三个浓度对心肌收缩力、收缩频率、增殖曲线、场电位时程均不产生统计学意义的影响;1μmol·L-1、10μmol·L-1的胺碘酮给药后,显示出对hiPSC-CM收缩力、收缩频率的完全抑制;1μmol·L-1、10μmol·L-1的胺碘酮给药后48h开始显示出统计学差异的细胞数量减低作用,显示出细胞脱落增多,且10 μmol·L-1组细胞减少数量比1μmol·L-1组稍多,但并无统计学差异;10μmol·L-1的胺碘酮给药后12h,显示出对hiPSC-CM自主则的完全抑制;而1μmol·L-1浓度处理组大部分自主完全抑制,尚有少数仍有搏动。3.维拉帕米对hiPSC-CM相关指标的影响为了验证维拉帕米对hiPSC-CM相关指标的影响,我们检测了 hiPSC-CM的搏动状态、收缩力、收缩频率、增殖曲线和场电位时程(FPDc)。结果显示:hiPSC-C

关键词：人诱导多能干细胞分化的心肌细胞 PM2.5 维拉帕米阿霉素胺碘酮

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Vernakalant在1型短QT综合征患者诱导多能干细胞分化心肌细胞中的抗心律失常作用

Vernakalant在1型短QT综合征患者诱导多能干细胞分化心肌细胞中的...

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作者：黄雪梅西南医科大学

学位级别：硕士

目的:遗传性短QT综合征(Short QT syndrome,SQTS)是一种罕见的遗传性心脏疾病,其特征是心电图QT间期缩短,可能会导致心源性猝死。SQTS的患病率为0.02%～0.1%,以男性为主,患者大多数心脏事件(>80%)发生在安静或睡眠状态。目前已发现6种S... 详细信息

目的:遗传性短QT综合征(Short QT syndrome,SQTS)是一种罕见的遗传性心脏疾病,其特征是心电图QT间期缩短,可能会导致心源性猝死。SQTS的患病率为0.02%～0.1%,以男性为主,患者大多数心脏事件(>80%)发生在安静或睡眠状态。目前已发现6种SQTS亚型,其中SQTS1、SQTS2和SQTS3与钾通道功能增强有关,而SQTS4-6则与钙通道功能丧失有关。到目前为止,除了奎尼丁之外,没有任何药物被证明对SQTS1型(Short QT syndrome type 1,SQTS1)患者有临床治疗效果,常用的治疗手段是对有SCD家族史且QT间期较短的患者植入ICD(Implantable cardioverter defibrillator,ICD)。由于奎尼丁有较大的副作用,在多个国家限制性或禁止使用,而ICD也并不适用于所有的SQT1患者,因而寻找新的有效的治疗药物具有重要的意义。Vernakalant是一种新型抗心律失常药物,可混合性阻断钠通道和钾通道,目前主要用于治疗心房颤动。已有研究报道vernakalant可以延长获得性SQT兔的APD和QT间期,但其对遗传性SQTS患者的作用还未见报道。人诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞(human induced pluripotent stem cells differentiated cardiomyocytes,hi PSC-CMs)来源于人类,且表达心肌细胞所有的离子通道类型并能在体外大量获取,目前已应用在心脏疾病模型构建、药物发现与验证、药物疗效及安全性测试、生物治疗等多个方面,是理想的研究心脏疾病的细胞模型。在前期研究中,本实验小组已成功构建了1型短QT综合征患者的hi PSC-CMs模型,并开展了分子和电生理特性研究,证实这一模型可复制1型短QT综合征的病理特性,可用于后续的病理机制和药物疗效研究。本研究将利用SQTS1型患者的诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hi PSC-CMs),探索vernakalant对SQTS1型患者的潜在治疗效果。方法:(1)获得SQTS1型患者来源的hi PSCs(SQTS1-hi PSC-CMs),以及正常人来源的hi PSCs。(2)采用免疫荧光技术对hi PSCs干性进行鉴定与检测,检测特异性干细胞标志物的表达情况。(3)将hi PSCs定向诱导分化为心肌细胞,以出现搏动团块为标志认为分化成功。(4)采用免疫荧光技术对hi PSCs定向诱导分化的心肌细胞进行鉴定与检测,检测心肌细胞特异性标志物的表达情况。(5)使用膜片钳技术记录不同浓度的vernakalant对动作电位参数的影响,以确定后续实验所需最适浓度。(6)利用钙瞬变记术,分析vernakalant对心律失常发生率的影响。(7)利用膜片钳技术分析vernakalant对SQTS1-hi PSC-CMs参与动作电位的主要离子通道电流的影响。(8)作为SQTS1的正常对照,利用膜片钳技术分析vernakalant对正常人来源的hi PSC-CMs的动作电位以及离子通道电流的作用。结果:(1)人诱导多潜能干细胞(hi PSCs)鉴定:免疫荧光结果显示hi PSCs表达特异性干细胞标记物TRA-1-60、SSEA4、OCT4和NANOG,提示其具有多向分化潜能;(2)hi PSC-CMs在分化第8-10天出现搏动细胞团块,免疫荧光结果显示分化得到的心肌细胞表达心肌骨架蛋白α-actinin以及心肌特异肌钙蛋白c Tn T,提示分化获得的细胞为心肌细胞;(3)分别加入3μM、10μM和30μM的vernakalant,在10μM和30μM的浓度下vernakalant显著延长了SQTS1-hi PSC-CMs的动作电位时程(Action potential duration,APD),包括APD50和APD90,并可抑制最大上升速率,和前期报道的对钠通道的阻断作用一致,结果具有浓度依赖性,选取10μM用于后续实验;(4)在10μM和30μM两个浓度,vernakalant在0.5 Hz、1 Hz和3 Hz三个频率都延长了APD,没有明显的频率依赖性;(5)钙瞬变结果显示,在自主搏动的SQTS1-hi PSC-CMs中,vernakalant减少了由卡巴可和肾上腺素共同作用诱发的心律失常的发生率;(6)Vernakalant未能抑制HERG通道电流,但减少了外向的小电导钙激活钾通道电流(I);(7)Vernakalant增强了Na/Ca交换体电流(I)和晚钠电流(late I),与它的APD延长作用一致;(8)Vernakalant可延长正常人来源的hi PSC-CMs的APD50和APD90,并可抑制最大上升速率;(9)Vernakalant可增强正常人来源的hi P

关键词：短QT综合征心律失常抗心律失常药物 vernakalant 人诱导多能干细胞分化的心肌细胞

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药物诱导的心律失常非临床体外评价研究进展

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中国药学杂志 2020年第13期55卷 1053-1059页

作者：潘东升王三龙张颖丽陈思蓉李波中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室北京100176

药物诱导的心律失常是导致药物研发失败的主要原因之一,也是导致药物撤市的主要原因,因此在非临床研究中准确地预测药物诱导的心律失常是降低研发失败和临床不良反应的最佳方法。笔者以“drug-induced arrhythmia”,“torsade de pointe... 详细信息

药物诱导的心律失常是导致药物研发失败的主要原因之一,也是导致药物撤市的主要原因,因此在非临床研究中准确地预测药物诱导的心律失常是降低研发失败和临床不良反应的最佳方法。笔者以“drug-induced arrhythmia”,“torsade de pointes”,“human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes”等为关键词在PUBMED、METSTR、CNKI和百度学术数据库中检索到1479篇文献,筛选后63篇符合要求;通过对文献的整理和数据分析,笔者总结了药物诱导心律失常体外评价模型的优缺点以及体外评价方法对不同类型化合物的敏感性和特异性,以期为毒性研究提供参考。

关键词：药物诱导的心律失常尖端扭转型室性心律失常人诱导多能干细胞分化的心肌细胞动作电位场电位 hERG通道阻滞

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不同测定条件对药物作用hERG钾通道的影响研究

不同测定条件对药物作用hERG钾通道的影响研究

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作者：孙红云中国医药工业研究总院

学位级别：硕士

研究背景及目的hERG基因(human ether-a-go-go related gene)编码快速激活的延迟整流钾通道(I),I在心脏复极过程中起到重要作用,药物阻滞I会导致QT间期延长,诱发尖端扭转性室速(Torsade de Pointes,TdP)。QT间期延长是新药安全性评价的... 详细信息

研究背景及目的hERG基因(human ether-a-go-go related gene)编码快速激活的延迟整流钾通道(I),I在心脏复极过程中起到重要作用,药物阻滞I会导致QT间期延长,诱发尖端扭转性室速(Torsade de Pointes,TdP)。QT间期延长是新药安全性评价的关键指标之一,hERG钾通道检测是临床前评价药物心脏安全性的关键步骤。膜片钳技术是研究离子通道特性和进行体外药物筛选的金标准,该技术难度大、程序复杂、细节要求高。我国仅有少数GLP机构可开展GLP条件下的hERG实验。由于缺乏统一的操作规范,不同实验室所采用的细胞系类型和电压刺激程序等也不同,得出的结果差异较大。通过在GLP实验室采用不同电压刺激程序研究不同程度致TdP风险药物对hERG钾通道的阻滞作用,以判断不同类型药物的检测条件,为国内GLP实验室进行hERG钾通道评价研究提供参考依据,进而推广到全国的药物心脏毒性安全性评价,从而统一操作规范,以便降低各实验室的差异性、提高各实验室数据的准确性和可重复性,更准确地评估心律失常风险。目前,hERG钾通道检测最常用的是异源转染hERG钾通道的哺乳动物细胞,只表达单一的hERG钾通道,缺乏自然心肌细胞环境中的复杂离子通道作用,而人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes,hiPSC-CM)是目前较趋近于人心肌细胞的细胞模型,具有较完整的电生理特性,更能反映药物的真实作用。研究方法与结果本研究共分三个部分。第一部分:采用斜坡刺激程序研究药物对HEK293细胞hERG钾通道的作用。研究11种不同程度致TdP风险的临床用药物(高风险:苄普地尔、奎尼丁、索他洛尔和多菲利特;中风险:昂丹司琼、西沙必利、特非那定;低风险:雷诺嗪、维拉帕米、地尔硫卓和美西律)对外源稳定转染表达hERG钾通道的HEK293细胞(hERG-HEK293稳态细胞)上的hERG钾通道的阻断作用。采用斜坡刺激程序记录不同浓度的上述药物作用于hERG-HEK293稳态细胞后hERG钾电流(I)的变化,研究上述药物对I作用的浓度依赖性、时间依赖性和半数抑制浓度(IC)。结果表明,上述11种药物对hERG-HEK293细胞上I的作用具有浓度依赖性,奎尼丁、索他洛尔、昂丹司琼、地尔硫卓、雷诺嗪和美西律与hERG钾通道作用较快,苄普地尔、多菲利特、西沙必利、特非那定和维拉帕米与hERG钾通道作用较慢。高风险药物苄普地尔、奎尼丁和多菲利特的IC值分别约为98.32 nmol·L、1.95μmol·L和52.71 nmol·L,索他洛尔的IC值大于300μmol·L;中风险药物昂丹司琼、西沙必利和特非那定的IC值分别约为0.94μmol·L、39.10 nmol·L和128.58 nmol·L;低风险临床用药物雷诺嗪、维拉帕米、地尔硫卓和美西律的IC值分别约为9.94μmol·L、235.49 nmol·L、12.40μmol·L和65.56μmol·L。本实验所得药物IC值基本与文献相符。第二部分:采用尾电流刺激程序研究药物对HEK293细胞hERG钾通道的作用。在第一部分的基础上,研究其中9种不同程度致TdP风险药物(高风险:苄普地尔、奎尼丁和索他洛尔;中风险:昂丹司琼、西沙必利、特非那定;低风险:雷诺嗪、地尔硫卓和美西律)对hERG-HEK293稳态细胞上hERG钾通道的阻断作用。采用尾电流刺激程序记录不同浓度的上述药物作用于hERG-HEK293稳态细胞后I的变化,研究上述药物对I作用的浓度依赖性及半数抑制浓度(IC)。结果显示,9种药物对hERG-HEK293细胞上I的作用具有浓度依赖性,高风险药物苄普地尔、奎尼丁和索他洛尔的IC值分别约为92.16 nmol·L、0.88μmol·L和278.65μmol·L;中风险药物昂丹司琼、西沙必利和特非那定的IC值分别约为0.57μmol·L、37.82 nmol·L和45.19 nmol·L;低风险药物雷诺嗪、地尔硫卓和美西律的IC值分别约为8.83μmol·L、10.79μmol·L和25.23μmol·L。本实验所得药物IC值基本与文献基本相符,且采用尾电流刺激程序得出的IC值略小于斜坡刺激程序。第三部分:研究药物对人诱导多能干细胞分化的心肌细胞钾通道的作用。首先,建立hiPSC-CM上钾电流的记录方法,然后采用建立的方法记录不同浓度苄普地尔作用于hiPSC-CM后钾电流和钾通道激活电流的变化,研究苄普地尔对钾电流作用的浓度依赖性、半数抑制浓度(IC)及电压依赖性,并与HEK293的结果相比较。结果显示,苄普地尔对hiPSC-CM上钾电流的作用具有浓度依赖性和电压依赖性,其IC值为8

关键词：尖端扭转性室速 hERG钾通道全细胞膜片钳电压刺激程序人诱导多能干细胞分化的心肌细胞

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电刺激对hiPSC-CMs的作用及其机制的研究

电刺激对hiPSC-CMs的作用及其机制的研究

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作者：耿乐南京医科大学

学位级别：硕士

由心动过速及长程起搏引发的心功能异常甚至死亡事件在临床上并不少见,但是它们各自在细胞水平的改变和如何导致这些心功能紊乱的机制仍然知之甚少。本研究通过对人诱导多能干细胞分化的心肌细胞（hiPSC-CMs）分别实施快速电刺激和长程... 详细信息

由心动过速及长程起搏引发的心功能异常甚至死亡事件在临床上并不少见,但是它们各自在细胞水平的改变和如何导致这些心功能紊乱的机制仍然知之甚少。本研究通过对人诱导多能干细胞分化的心肌细胞（hiPSC-CMs）分别实施快速电刺激和长程电刺激来模拟临床心动过速和长程起搏。其中快速电刺激频率为3Hz,时间为7天。设置8h/24h和24h/24h两个亚组分别代表短期和长期心动过速,同时设置频率为1Hz,时间为7天,刺激时间为24h/24h作为阴性对照组。长程电刺激组刺激频率为1.2Hz,时间为2周,并设置起搏百分比为40%和100%的两个亚组。两种电刺激均以未经刺激处理的hiPSC-CMs作为对照组。刺激结束后,通过对刺激后心肌细胞进行免疫荧光染色和透射电镜来观察细胞结构,通过Hoechst染色和AV/PI流式分析来评估细胞凋亡,通过膜片钳技术分析细胞电生理特点,通过JC-1染色检测线粒体功能状态,通过Western Blot和qPCR明确基因表达。与对照组相比,接受快速电刺激的心肌细胞表现出明显的线粒体功能受损;凋亡比例增加,钙瞬变及钙电流幅度明显减小。凋亡基因Caspase3和促凋亡基因BAX表达增多,抑制凋亡基因BCL表达减少。与细胞内钙回收相关的基因表达减少,而磷酸化状态的钙调蛋白激酶Ⅱ（CaMKII）明显被激活。对照组和慢刺激阴性对照组在上述各方面无显著性差异。快速电刺激同时,用1μM的CaMKⅡ抑制剂KN93可以部分逆转快速电刺激的副作用。与对照组相比,长程起搏刺激后心肌细胞凋亡比例明显增加,细胞收缩相关蛋白cTnT的表达明显减少,动作电位缩短,离子电流密度减小,内质网应激和Calpain活性增强,而且这些改变呈现出起搏百分比依赖性。用Calpeptin抑制Calpain活性可以缓解长程起搏引发的上述不良反应。在本研究中,我们发现快速电刺激扰乱了钙稳态并激活线粒体凋亡途径,从而导致心肌细胞丢失和收缩功能不全。同时快频率电刺激后磷酸化CaMKⅡ水平明显上调,抑制CaMKⅡ能部分逆转快速电刺激带来的不良反应。长程电刺激对心肌细胞的结构特点和电生理特点均产生不良反应,刺激后内质网应激和下游Calpain活性增强,通过抑制Calpain能够部分纠正长程电刺激带来的不良反应。CaMKⅡ和Calpain可能成为临床心律失常病人治疗的新靶点。

关键词：人诱导多能干细胞分化的心肌细胞电刺激细胞凋亡钙稳态内质网应激 CaMKⅡ Calpain

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基于hiPSC-CM细胞模型和毒性通路测试的化学物心血管毒性评价及应用

基于hiPSC-CM细胞模型和毒性通路测试的化学物心血管毒性评价及应...

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中国毒理学会第九次全国毒理学大会

作者：李宇杰李凤祥彭双清郭家彬刘超中国人民解放军疾病预防控制中心

目的心血管系统是外源性化学物毒作用的重要靶器官,采用合适的体外模型对其进行风险评估成为近年来心血管毒理学发展的重要方向。随着替代毒理学、高通量测试和干细胞技术的快速发展,基于人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CM)模型... 详细信息

目的心血管系统是外源性化学物毒作用的重要靶器官,采用合适的体外模型对其进行风险评估成为近年来心血管毒理学发展的重要方向。随着替代毒理学、高通量测试和干细胞技术的快速发展,基于人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CM)模型和毒性通路测试的心脏毒性快速筛选优势得以发挥。本研究应用一种与人类心肌生理生化功能高度类似的hiPSC-CM为模型,基于毒性机制/通路测试方法,对已证实有明显心脏毒性的多柔比星(DOX)和有潜在心脏毒性的纳米氧化锌(ZnO NPs)进行评价,拓展新模型、新技术的应用。方法将hiPSC单层培养定向分化为心肌细胞(hiPSC-CM),验证后用于体外心血管毒性评价;将DOX和ZnO NPs分别与hiPSC-CM孵育,利用经典毒性测试方法和高内涵成像分析技术,测定细胞毒性、线粒体功能、氧化应激和其对线粒体生成功能调节等毒性通路的扰动作用,观察两种化学物的毒性特征。结果 iPSC在定向分化第10天左右开始跳动,呈心肌特征,培养至第25～30天细胞较成熟稳定,利用GFP标记心肌标志蛋白NKX2.5,分化效率达到90%以上。DOX和ZnO NPs可呈剂量和时间依赖性降低细胞存活率和增加乳酸脱氢酶漏出,分别在0.1μmol·L(24 h)在62.5μmol·L(24 h)和产生显著细胞毒性。利用高内涵成像分析,两种化学物均可引起线粒体膜电位下降、线粒体丰度下降和全细胞活性氧蓄积,诱发线粒体损伤和氧化应激。检测发现mtDNA拷贝数呈剂量依赖性下降,进一步证实了线粒体功能损伤。通过检测线粒体新生和氧化应激相关通路蛋白,化学物可使PGC-1α及其下游NRF1、TFAM表达下调,使Nrf2及其下游SOD2表达上调。结论本研究建立了基于iPSC-CMs的化学物心血管毒性体外评价模型,证实了DOX和ZnO NPs可影响线粒体功能、诱发氧化应激进而导致细胞毒性,提示PGC-1α和Nrf2通路可作为心血管毒性评价的毒性通路。

关键词：人诱导多能干细胞分化的心肌细胞毒性通路心血管毒性

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基于人源心肌细胞体外心律失常模型的建立

基于人源心肌细胞体外心律失常模型的建立

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第四届（2023年）中国安全药理学学术年会

作者：潘东升王三龙中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心

目的:药物诱导的心脏毒性仍然是候选化合物研发失败和上市后召回的主要原因之一。因此,在化合物开发过程中早期识别具有潜在毒性的候选化合物至关重要。人诱导多能干细胞分化的心肌细胞预期成为候选化合物促心律失常评价的有用工具,然而... 详细信息

目的:药物诱导的心脏毒性仍然是候选化合物研发失败和上市后召回的主要原因之一。因此,在化合物开发过程中早期识别具有潜在毒性的候选化合物至关重要。人诱导多能干细胞分化的心肌细胞预期成为候选化合物促心律失常评价的有用工具,然而,使用人心肌细胞预测尖端扭转型室性心律失常（Torsade de pointes,TdP）风险模型未完全建立,本研究的目的是基于人心肌细胞,使用机器学习分类器,建立尖端扭转型室性心律失常预测模型。方法:以人诱导多能干细胞分化的心肌细胞为研究对象,以化合物对心肌细胞的电生理反应为预测指标建立风险评估模型。以综合体外致心律失常项目（CiPA）公布的28种化合物作为训练集,将中高TdP风险化合物合并,对低TdP风险化合物进行建模。以最大血药浓度(C),节律失常事件及对应Cmax倍数;场电位改变类型及改变量,以及对应Cmax倍数作为建模指标。以准确性、敏感性和AUC作为模型评价指标。使用7个作用机理明确的非CiPA项目化合物作为测试集对模型进行验证。结果:在7种模型中,逻辑回归和AdaBoost模型AUC值较高,说明模型区分能力强;且这2个模型的AUC在训练集和测试集中差异小,说明模型稳定性好。所以将这2个模型作为子模型,设置相同权重并使用软投票策略构建新的Tdp风险预测模型。新模型在训练集上的分类准确度、敏感性和AUC分别为0.93、0.95和0.92;在测试集上的分类准确度、敏感性和AUC均为1.00,新模型在训练集和测试集上均表现出良好的区分能力。以0.5作为新模型的风险判定阈值,使用该阈值,训练集中预测结果与实际结果的一致性为92.8%,测试集的一致性为100%。结论:本研究建立了基于人诱导多能干细胞分化的心肌细胞体外TdP风险预测模型,该模型可作为一种有效的预测工具,在临床前对化合物诱导的心律失常进行评价。

关键词：人诱导多能干细胞分化的心肌细胞心律失常 TdP 风险评估

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基于hiPSC-CMs的非临床体外Tdp风险预测模型建立及验证

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第四届（2023年）中国安全药理学学术年会

作者：潘东升王三龙中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心

目的:药物诱导的心脏心脏毒性仍然是候选化合物研发失败和上市后召回的主要原因之一。因此,在化合物开发过程中早期识别具有潜在毒性的候选化合物至关重要。人诱导多能干细胞分化的心肌细胞预期成为候选化合物促心律失常评价的有用工具... 详细信息

目的:药物诱导的心脏心脏毒性仍然是候选化合物研发失败和上市后召回的主要原因之一。因此,在化合物开发过程中早期识别具有潜在毒性的候选化合物至关重要。人诱导多能干细胞分化的心肌细胞预期成为候选化合物促心律失常评价的有用工具,然而,使用人心肌细胞预测尖端扭转型室性心律失常（Torsade de pointes,TdP）风险模型未完全建立,本研究的目的是基于人心肌细胞,使用机器学习分类器,建立尖端扭转型室性心律失常预测模型。方法:以人诱导多能干细胞分化的心肌细胞为研究对象,以化合物对心肌细胞的电生理反应为预测指标建立风险评估模型。以综合体外致心律失常项目（CiPA）公布的28种化合物作为训练集,将中高TdP风险化合物合并,对低TdP风险化合物进行建模。以最大血药浓度(C),节律失常事件及对应C倍数;场电位改变类型及改变量,以及对应Cmax倍数作为建模指标。以准确性、敏感性和AUC作为模型评价指标。使用7个作用机理明确的非CiPA项目化合物作为测试集对模型进行验证。结果:在7种模型中,逻辑回归和AdaBoost模型AUC值较高,说明模型区分能力强;且这2个模型的AUC在训练集和测试集中差异小,说明模型稳定性好。所以将这2个模型作为子模型,设置相同权重并使用软投票策略构建新的Tdp风险预测模型。新构建的模型与逻辑回归和AdaBoost模型相比较,新模型在训练集上的分类准确度、敏感性和AUC分别为0.93、0.95和0.92;在测试集上的分类准确度、敏感性和AUC均为1.00,新模型在训练集和测试集上均表现出良好的区分能力。以0.5作为新模型的风险判定阈值,使用该阈值,训练集中预测结果与实际结果的一致性为92.8%,测试集的一致性为100%。结论:本研究建立了基于人诱导多能干细胞分化的心肌细胞体外TdP风险预测模型,该模型可作为一种有效的预测工具,在临床前对化合物诱导的心律失常进行评价。

关键词：人诱导多能干细胞分化的心肌细胞心律失常 TdP 风险评估

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