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人血管抑素Kringles 1-3的表达纯化及生物学活性研究

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中国生物工程杂志 2011年第1期31卷 24-28页

作者：李壮林姚雪静原桂勇山东先声麦得津生物制药有限公司烟台264006 烟台荣昌生物工程有限公司烟台264006

人血管抑素包含了4个环饼状结构域(Kringle),是一个有效的血管生成抑制因子。采用PCR方法从人胚肝cDNA文库中扩增了人血管抑素Kringles1-3的基因,重组于pPIC9K载体中,获得重组载体pPIC9K-K1-3,然后转化毕赤酵母细胞GS115,获得重组菌株。... 详细信息

人血管抑素包含了4个环饼状结构域(Kringle),是一个有效的血管生成抑制因子。采用PCR方法从人胚肝cDNA文库中扩增了人血管抑素Kringles1-3的基因,重组于pPIC9K载体中,获得重组载体pPIC9K-K1-3,然后转化毕赤酵母细胞GS115,获得重组菌株。K1-3蛋白在5 L发酵罐的表达量达41.2 mg/L,发酵液上清经过浓缩、透析,然后用Lysine Sepharose 4B层析柱纯化,得到的K1-3蛋白纯度大于98%,纯化回收率达到95%以上。K1-3能明显抑制bFGF刺激的人微血管内皮细胞的迁移,达到抑制效果为50%时所需的蛋白浓度(IC50)为1.86μg/ml。K1-3也能抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长,抑制率达95%。为应用人血管抑素Kringles1-3治疗肿瘤奠定了初步实验基础。

关键词：人血管抑素表达纯化活性研究毕氏酵母

体外培养下可持续分泌人血管抑素和内皮抑素基因工程细胞对血管生成的抑制效应

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第20期13卷 3886-3889页

作者：潘静坤赵卉田磊崔忻高宇红薛毅珑解放军总医院老年医学研究所细胞生物学研究室北京市100853 解放军总参谋部管理保障部中心门诊部北京市100034

背景:以往实验构建了可持续分泌人血管抑素和内皮抑素的基因工程细胞,即人血管抑素/293细胞和人内皮抑素293细胞,并已证明可持续分泌人血管抑素蛋白和人内皮抑素蛋白。但尚不了解其分泌物是否能发挥血管生成的抑制作用。目的:观察以基... 详细信息

背景:以往实验构建了可持续分泌人血管抑素和内皮抑素的基因工程细胞,即人血管抑素/293细胞和人内皮抑素293细胞,并已证明可持续分泌人血管抑素蛋白和人内皮抑素蛋白。但尚不了解其分泌物是否能发挥血管生成的抑制作用。目的:观察以基因工程技术构建的人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞对鸡胚尿囊膜血管新生的抑制效应。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/2007-01在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学研究室完成。材料:Hek/293细胞为人胚胎肾细胞,由解放军军事医学科学院提供。人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞由课题组前期构建。SPF级鸡胚购自北京维通利华实验动物有限公司。方法:将鸡胚消毒后,置于37℃无菌恒温箱中孵育5d,在距胚头1cm两条卵黄静脉之间的卵壳投影部位磨切暴露尿囊膜,制成假气室,用无菌滤纸封闭窗口,制成鸡胚尿囊膜模型,备用。用灭菌蒸馏水配制体积分数为0.5%甲基纤维素溶液,制成甲基纤维素小杯。卵壳开窗后第3天,分别吸取浓缩的293细胞、人血管抑素/293细胞、人内皮抑素/293细胞培养上清液各20μL,或人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞培养上清液各10μL,加于甲基纤维素小杯中,将其置于鸡胚尿囊膜的两条大血管之间的无血管区。主要观察指标:观察尿囊膜血管生成的变化。结果:共培养9d时,与单纯293细胞上清液组相比,人血管抑素/293细胞上清液或人内皮抑素/293细胞上清液组,甲基纤维素小杯内及邻近区的鸡胚尿囊膜血管明显发育不良,血管分布稀疏,数量明显减少,其一级血管数量虽未明显减少,但其管径较细,而二级血管和三级以下的血管数量明显减少、管径明显变细,伸入尿囊膜边缘区的血管数量减少,管径明显变细。与人血管抑素/293细胞组或人内皮抑素/293细胞组相比,人血管抑素/293细胞+人内皮抑素/293细胞组的一级血管数量和管径未见明显变化,而其二级血管和三级以下血管数量明显减少,血管树消失。结论:人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞的分泌物对鸡胚尿囊膜的血管新生均具有明显的抑制作用,且联合用药抑制作用增强。

关键词：人血管抑素人内皮抑素基因工程细胞鸡胚尿囊膜血管新生

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重组大肠杆菌生产人血管抑素的发酵条件

无锡轻工大学学报（食品与生物技术） 2004年第2期23卷 8-11页

作者：邵玲莉周楠迪吴奇凡金坚田亚平江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214036

对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达... 详细信息

对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达量达到560mg/L.

关键词：人血管抑素重组大肠杆菌发酵条件 pQE32-AGN 产物表达

竞争酶联免疫吸附试验检测人血管抑素的方法建立及其应用研究

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中华检验医学杂志 2004年第12期27卷 864-866页

作者：何杨沈文红陶永辉阮长耿苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所 215006 江南大学教育部重点实验室

目的　研究建立竞争酶联免疫吸附试验 (竞争ELISA)检测血管抑素的方法 ,并探讨其临床应用价值。方法　以重组人血管抑素作为抗原免疫家兔 ,制备抗人血管抑素多克隆抗体 ,建立竞争ELISA法 ,并检测 6 1例肿瘤患者和 2 0名正常献血员血浆... 详细信息

目的　研究建立竞争酶联免疫吸附试验 (竞争ELISA)检测血管抑素的方法 ,并探讨其临床应用价值。方法　以重组人血管抑素作为抗原免疫家兔 ,制备抗人血管抑素多克隆抗体 ,建立竞争ELISA法 ,并检测 6 1例肿瘤患者和 2 0名正常献血员血浆中血管抑素含量。结果　竞争ELISA法的灵敏度为 5mg/L ,批内和批间变异分别为 2 7%～ 3 2 %和 4 9%～ 5 1% ,平均回收率为10 0 4 %。血浆血管抑素含量在 2 0名献血员中为 2 7 2 2± 7 4 4mg/L ,2 8例胃癌患者为 5 7 15±2 9 90mg/L ,6例乳腺癌为 6 7 5 1± 2 0 88mg/L ,6例肝癌为 92 0 3± 18 72mg/L ,11例急性淋巴细胞性白血病为 4 1 72± 9 99mg/L ,10例其他肿瘤 (2例胆囊癌 ,3例结肠癌 ,2例前列腺癌 ,3例卵巢癌 )为 78 78± 2 0 4 4mg/L ,均显著高于正常人 (P 人血管抑素的方法 ,并可作为肿瘤诊断的一种新检测指标。

关键词：人血管抑素酶联免疫吸附试验献血员血浆肿瘤 ELISA 含量结论灵敏方法

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人血管抑素基因工程菌发酵条件的初步研究

广州医学院学报 2000年第3期28卷 1-3页

作者：卢文菊罗进贤何建国张添元广州医学院检验系广州510182 中山大学生命科学学院广州510275

目的 :探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组人血管抑素 (rhAGN)的影响。方法 :应用摇瓶和发酵罐发酵试验观察不同诱导时机和诱导时间以及 pH、通气量等对rhAGN表达量的影响。结果 :(1)工程菌E .coliDH5α(pBVA2 )在 30℃培养至A60 0nm... 详细信息

目的 :探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组人血管抑素 (rhAGN)的影响。方法 :应用摇瓶和发酵罐发酵试验观察不同诱导时机和诱导时间以及 pH、通气量等对rhAGN表达量的影响。结果 :(1)工程菌E .coliDH5α(pBVA2 )在 30℃培养至A60 0nm 为 0 .3～ 0 .5时于 4 2℃诱导4hrhAGN表达量最高 ,约为 2 12mg L ;(2 ) 15L发酵罐发酵参数为 pH7.2 ,搅拌转速 50 0r min ,通气量 4～ 8L min ,溶氧 50 %时 ,rhAGN表达量提高到 2 76mg L。结论 :确定了最适诱导时机和诱导时间 ,通过调节 pH和改善通气 ,初步形成了一套高表达rhAGN的发酵工艺。

关键词：人血管抑素基因表达大肠杆菌发酵

人尿血管抑素测定方法的建立及在肿瘤患者中的应用

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郑州大学学报（医学版） 2004年第2期39卷 255-257页

作者：鲁照明薛乐勋董子明郑州大学医学实验中心细胞生物学研究室郑州450052

目的:建立一种测定人尿液中血管抑素的方法,并探讨其在肿瘤患者中测定的意义。方法:依据ELISA的原理和技术要求,以赖氨酸作固相包被物,血管抑素为标准品,抗入K1～3的单抗为特异性的一抗,制备测定血管抑素的ELISA试剂盒。用此方法测定40... 详细信息

目的:建立一种测定人尿液中血管抑素的方法,并探讨其在肿瘤患者中测定的意义。方法:依据ELISA的原理和技术要求,以赖氨酸作固相包被物,血管抑素为标准品,抗入K1～3的单抗为特异性的一抗,制备测定血管抑素的ELISA试剂盒。用此方法测定40例健康人(正常对照组)、92例恶性肿瘤(31例肺癌、31例食管癌、30例乳癌)患者治疗前尿中血管抑素含量。结果:该ELISA方法检测人尿中血管抑素的检出范围为1～200μg/L。正常对照组中尿血管抑素含量为0～27.4μg/L,x±s(16.15±6.82)μg/L。3种肿瘤患者尿中血管抑素平均水平均高于正常对照组(P0.05)。结论:该方法操作方便,敏感性、特异性高;人尿中血管抑素含量检测可用于某些肿瘤的检出。

关键词：人血管抑素 ELISA 肿瘤尿

人血管抑制素（K1-3）在家蚕细胞和幼虫中的表达及其生物活性研究

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人血管抑制素（K1-3）在家蚕细胞和幼虫中的表达及其生物活性研究

作者：王莹飞浙江大学

学位级别：硕士

人血管抑素(angiostatin)是O'Reilly等在Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分离纯化出的大小约为38 kD的蛋白质，它包含了血纤溶酶原(plasminogen)前4个环饼状结构域，即血管抑素(K1-4)。其能通过抑制肿瘤新生血管的生成，切断肿瘤血液和营... 详细信息

人血管抑素(angiostatin)是O'Reilly等在Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分离纯化出的大小约为38 kD的蛋白质，它包含了血纤溶酶原(plasminogen)前4个环饼状结构域，即血管抑素(K1-4)。其能通过抑制肿瘤新生血管的生成，切断肿瘤血液和营养的供应，从而抑制肿瘤的生长和转移。目前通过抑制新生血管的形成来治疗肿瘤已成为攻克肿瘤的又一靶点。研究表明血管抑素(K1-3)抑制内皮细胞增殖的能力强于血管抑素(K1-4)，第4个环饼状结构域对抑制内皮细胞的增殖没有直接的关系。因此，在本实验中我们用家蚕杆状病毒表达系统表达了人血管抑素(K1-3)，并研究了其对内皮细胞凋亡和鸡胚新生血管生长的影响，阐明了其与内皮抑素的协同作用。本研究首先将人血管抑素(angiostatin)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，获得重组转移载体pBacPAK-angiostatin，并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞株，获得重组病毒BacPAK-angiostafin。PCR和DNA点杂交结果表明重组病毒基因组中含有血管抑素基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕细胞(2×10～6个细胞/5 ml)和家蚕5龄幼虫，表达产物用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)及体内鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管实验检测其抑制活性：(一)血管抑素可明显抑制体外培养的内皮细胞增殖。表达产物活性在家蚕细胞中表达72小时达到最高值，经胞内表达产物作用后，血管内皮细胞的存活率仅为(28.0±3.0)％，表达量约为22u／2×10～6个细胞;在家蚕体内表达144小时活性达到最高值，内皮细胞的存活率仅为(6.4±0.5)％，表达量约159u／ml。(二)在鸡胚尿囊膜(CAM)实验中，测得血管抑素能显著抑制鸡胚新生血管的形成。ELISA检测结果表明，表达产物能与兔抗人血管抑素一抗发生特异性的抗原抗体反应，即表达的人血管抑素(K1-3)具有抗原的反应原性。Western blotting结果表明，细胞表达产物出现一条大小约为36kD的特异性条带;家蚕体内的表达产物产生分子量约为37 kD和42 kD两条特异性条带。本实验还探讨了人血管抑素可能的作用机理和人血管抑素、人内皮抑素以及两者的协同作用对体外培养的内皮细胞的增殖和对体内鸡胚新生血管形成的影响，并将三者的作用效果进行了比较。分别以人血管抑素、内皮抑素和等量的两者的混合物加人到人脐静脉内皮细胞中继续培养36小时，用透射电镜法观察细胞形态的变化，发现三者都能诱导内皮细胞发生典型的凋亡现象，以凋亡率排序依次为：（人血管抑素呐皮抑素）＞人血管抑素＞人内皮抑素。同样，分别以三者进行鸡胚尿囊膜（CAM）实验，发现三者都能明显抑制新生血管形成，而以两者的协同作用效果最佳。综上所述，运用家蚕杆状病毒表达系统进行表达，可获得大量有生物活性的血管抑素，以满足用临床上大剂量应用，且大幅度降低成本，为今后在临床上的广泛应用打下基础。

关键词：人血管抑素家蚕杆状病毒表达系统表达