人血管抑制素（K1-3）在家蚕细胞和幼虫中的表达及其生物活性研究

作     者：王莹飞 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张耀洲;金勇丰

授予年度：2002年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：人血管抑素 家蚕杆状病毒表达系统 表达 

摘      要：人血管抑素(angiostatin)是O Reilly等在Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分离纯化出的大小约为38 kD的蛋白质，它包含了血纤溶酶原(plasminogen)前4个环饼状结构域，即血管抑素(K1-4)。其能通过抑制肿瘤新生血管的生成，切断肿瘤血液和营养的供应，从而抑制肿瘤的生长和转移。目前通过抑制新生血管的形成来治疗肿瘤已成为攻克肿瘤的又一靶点。研究表明血管抑素(K1-3)抑制内皮细胞增殖的能力强于血管抑素(K1-4)，第4个环饼状结构域对抑制内皮细胞的增殖没有直接的关系。因此，在本实验中我们用家蚕杆状病毒表达系统表达了人血管抑素(K1-3)，并研究了其对内皮细胞凋亡和鸡胚新生血管生长的影响，阐明了其与内皮抑素的协同作用。 本研究首先将人血管抑素(angiostatin)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，获得重组转移载体pBacPAK-angiostatin，并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞株，获得重组病毒BacPAK-angiostafin。PCR和DNA点杂交结果表明重组病毒基因组中含有血管抑素基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕细胞(2×10～6个细胞/5 ml)和家蚕5龄幼虫，表达产物用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)及体内鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管实验检测其抑制活性：(一)血管抑素可明显抑制体外培养的内皮细胞增殖。表达产物活性在家蚕细胞中表达72小时达到最高值，经胞内表达产物作用后，血管内皮细胞的存活率仅为(28.0±3.0)％，表达量约为22u／2×10～6个细胞;在家蚕体内表达144小时活性达到最高值，内皮细胞的存活率仅为(6.4±0.5)％，表达量约159u／ml。(二)在鸡胚尿囊膜(CAM)实验中，测得血管抑素能显著抑制鸡胚新生血管的形成。ELISA检测结果表明，表达产物能与兔抗人血管抑素一抗发生特异性的抗原抗体反应，即表达的人血管抑素(K1-3)具有抗原的反应原性。Western blotting结果表明，细胞表达产物出现一条大小约为36kD的 特异性条带;家蚕体内的表达产物产生分子量约为37 kD和42 kD两条特异性条 带。 本实验还探讨了人血管抑素可能的作用机理和人血管抑素、人内皮抑素以 及两者的协同作用对体外培养的内皮细胞的增殖和对体内鸡胚新生血管形成的 影响，并将三者的作用效果进行了比较。分别以人血管抑素、内皮抑素和等量 的两者的混合物加人到人脐静脉内皮细胞中继续培养36小时，用透射电镜法观 察细胞形态的变化，发现三者都能诱导内皮细胞发生典型的凋亡现象，以凋亡 率排序依次为：（人血管抑素呐皮抑素）人血管抑素人内皮抑素。同样， 分别以三者进行鸡胚尿囊膜（CAM）实验，发现三者都能明显抑制新生血管形 成，而以两者的协同作用效果最佳。 综上所述，运用家蚕杆状病毒表达系统进行表达，可获得大量有生物活性 的血管抑素，以满足用临床上大剂量应用，且大幅度降低成本，为今后在临床 上的广泛应用打下基础。