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miR-34a对人脂肪间充质干细胞成骨向分化的调控

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西安交通大学学报（医学版） 2018年第5期39卷 675-679,708页

作者：王亮钟武陈睦虎西南医科大学附属医院急诊科四川泸州646000

目的探讨miR-34a对人脂肪间充质干细胞(hASCs)成骨分化中相关蛋白的表达及相关作用机制。方法从西南医科大学附属医院接受选择性抽脂手术或其他腹部手术的捐赠者获得脂肪组织,并分离培养hASCs。分别使用miR-34a模拟物、抑制剂和阴性对... 详细信息

目的探讨miR-34a对人脂肪间充质干细胞(hASCs)成骨分化中相关蛋白的表达及相关作用机制。方法从西南医科大学附属医院接受选择性抽脂手术或其他腹部手术的捐赠者获得脂肪组织,并分离培养hASCs。分别使用miR-34a模拟物、抑制剂和阴性对照转染hASCs,并通过逆转录-聚合酶链反应检测miR-34a在hASCs成骨分化各时间点的表达,Western blot检测成骨细胞中RBP2、RNUX2、P27蛋白表达情况,用双荧光素酶报告基因测定系统测定海肾和萤火虫萤光素酶活性。结果与阴性对照组相比,在转染第0、4、8、12天,miR-34a模拟物组的细胞miR-34a表达水平显著升高(P<0.05),而miR-34a抑制剂组显著降低(P<0.05)。miR-34a模拟物组RBP2蛋白表达降低,而miR-34a抑制剂表达增加。双荧光素酶报告测定证实RBP2是miR-34a的直接靶标。此外,miR-34a模拟物组RUNX2和P27蛋白表达上调,而miR-34a抑制剂表达下调。结论 miR-34a在hASCs成骨分化中起促进作用,并可能通过靶向RBP2起作用。

关键词： miR-34a 人脂肪间充质干细胞成骨分化视网膜母细胞瘤结合蛋白2 RUNX2

三维培养诱导人脂肪间充质干细胞微球的成软骨分化能力

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中国组织工程研究 2015年第1期19卷 24-29页

作者：毕晓娟郭晨明李亮段显琳江明新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院干细胞研究室、新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054 新疆医科大学第一附属医院乳腺外科新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054 新疆医科大学第一附属医院血液病中心、新疆维吾尔自治区血液病研究所新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054

背景:关节软骨损伤后修复结果不满意,需要新的手段,而脂肪间充质干细胞较适宜做种子细胞诱导软骨,然而怎么能够使诱导的软骨具有功能需要研究。目的:采用三维培养体系诱导人脂肪间充质干细胞微球向软骨分化。方法:无菌切取吸脂术后脂肪... 详细信息

背景:关节软骨损伤后修复结果不满意,需要新的手段,而脂肪间充质干细胞较适宜做种子细胞诱导软骨,然而怎么能够使诱导的软骨具有功能需要研究。目的:采用三维培养体系诱导人脂肪间充质干细胞微球向软骨分化。方法:无菌切取吸脂术后脂肪组织,分离培养人脂肪间充质干细胞,传至第3代进行流式细胞术分析,成骨成脂肪诱导等鉴定,同时也给予合适的培养条件用三维培养的方式向软骨细胞诱导,并行阿利辛蓝染色鉴定糖胺多糖的合成,苏木精-伊红染色进行组织学分析,免疫荧光检测Ⅱ型胶原表达,称质量测量软骨硬度。结果与结论:分离的人脂肪间充质干细胞CD105,CD44,CD29均高表达,而CD45,CD34低表达,并且成骨成脂诱导后细胞茜素红染色和油红O染色均为阳性。三维培养法诱导的软骨细胞可表达大量糖胺多糖及Ⅱ型胶原。结果证实,三维培养法诱导人脂肪间充质细胞向软骨分化后,具有软骨细胞的特性。

关键词：组织工程干细胞间质干细胞软骨脂肪干细胞三维培养体系软骨微球诱导分化间充质干细胞脂肪源间充质干细胞人脂肪间充质干细胞无支架微球培养条件优化软骨诱导

N-(6-氨乙基)-5-氯-1-萘磺酰胺在体外对人脂肪间充质干细胞转分化为内皮细胞的影响

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中国医学科学院学报 2011年第3期33卷 306-312,351,352页

作者：翟羽佳陈嘉仉红刚张静张秋菊修瑞娟中国医学科学院北京协和医学院研究生院北京100730 中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所北京100005

目的研究N-(6-氨乙基)-5-氯-1-萘磺酰胺(W7)在体外对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)转分化为内皮细胞(EC)的影响。方法以含40 ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的干细胞无血清分化培养基进行细胞培养,... 详细信息

目的研究N-(6-氨乙基)-5-氯-1-萘磺酰胺(W7)在体外对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)转分化为内皮细胞(EC)的影响。方法以含40 ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的干细胞无血清分化培养基进行细胞培养,分为空白对照组(不含W7的分化培养基)和高(30μmol/L)、中(20μmol/L)、低(10μmol/L)剂量W7组。hADSCs加药8 d后,采用流式细胞术(FCM)检测各组EC von Willebrand因子(vWF)和血管选择性钙黏素(VE-Cadherin)表型变化,激光共聚焦显微镜检测钙荧光探针(Fluo-3)标记的细胞内[Ca2+]i变化;同时将W7处理后的hADSCs种植在Matrigel胶上,观察细胞成血管能力;采用Western blot技术分析不同浓度药物处理8 d后细胞外调节激酶(ERK)和磷酸化ERK(p-ERK)变化。结果分化至8 d时,与空白对照组相比,hADSCs转分化后的细胞VE-Cadherin和vWF表达量随W7浓度降低而显著上升(P细胞均有管腔样血管结构形成,空白对照组的细胞无血管管型形成。与空白对照组相比,不同剂量W7干预组间细胞的ERK表达水平差异无统计学意义(P>0.05);随着W7浓度的降低,p-ERK表达水平明显升高(P细胞内[Ca2+]i增加,激活细胞分化过程中的ERK/MAPK信号通路有关。

关键词： N-(6-氨乙基)-5-氯-1-萘磺酰胺人脂肪间充质干细胞内皮细胞诱导分化

人脂肪间充质干细胞体外诱导为肝脏样细胞的试验研究

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首都医科大学学报 2014年第5期35卷 608-616页

作者：张云巍徐丽娟王淑芳阎丽解放军总医院南楼临床部消化内科北京100853 解放军总医院输血科干细胞实验室北京100853

目的探讨人脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及向肝脏样细胞分化的方法。方法采用胶原酶Ⅰ消化离心法获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs),原代培养并采用流式细胞仪检测干细胞相关表面... 详细信息

目的探讨人脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及向肝脏样细胞分化的方法。方法采用胶原酶Ⅰ消化离心法获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs),原代培养并采用流式细胞仪检测干细胞相关表面抗原白细胞分化抗原13(Cluster differentiation13,CD13)、CD73、CD34、CD45和人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)的表达,采用诱导培养基将hADSCs向成脂及成骨方向诱导。采用两阶段细胞因子诱导法诱导hADSCs,并观察其形态变化;采用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法及细胞免疫组化法检测肝细胞相关基因甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18抗体(cytokeratin18,CK18)、细胞角蛋白19抗体(cytokeratin19,CK19)等在肝脏样细胞中的表达;采用糖元染色法(Periodic acid-Schiff stain,PAS)检测肝脏样细胞糖原合成情况。结果用消化离心法获取的hADSCs大小均匀,呈梭形的成纤维细胞样,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式细胞仪检测显示hADSCs高表达CD13、CD73,低表达CD34、CD45及HLA-DR;hADSCs体外可被诱导成脂肪细胞及成骨细胞。hADSCs经成肝诱导后,细胞形态由梭形变为多角形的肝脏样细胞,这些肝脏样细胞高表达血清白蛋白(serum albumin,ALB)、AFP、CY3P4等基因,并表达肝细胞相关性蛋白HepPar-1、AFP、CK18、CK19。PAS染色显示肝脏样细胞胞质呈红色表现。结论利用消化离心法在体外成功构建了人原代脂肪干细胞系,可长期存活,反复传代,经诱导后可转化为有功能的肝脏样细胞,为脂肪间充质干细胞作为生物人工肝及肝组织工程的种子细胞提供理论依据。

关键词：人脂肪间充质干细胞分离鉴定诱导肝脏样细胞

人脂肪间充质干细胞与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白体外构建组织工程脂肪的实验研究

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兰州大学学报（医学版） 2015年第6期41卷 12-19页

作者：王刚刘毅亢婷刘刚强兰州军区兰州总医院全军烧伤整形外科中心甘肃兰州730050

目的探讨人脂肪间充质干细胞（h ADSCs）与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白体外构建组织工程脂肪的可行性。方法选取生长良好的第3代h ADSCs,成血管内皮细胞诱导分化。h ADSCs和诱导的血管内皮细胞按4∶1接种于支架材料上共培养作为A组,单纯接... 详细信息

目的探讨人脂肪间充质干细胞（h ADSCs）与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白体外构建组织工程脂肪的可行性。方法选取生长良好的第3代h ADSCs,成血管内皮细胞诱导分化。h ADSCs和诱导的血管内皮细胞按4∶1接种于支架材料上共培养作为A组,单纯接种h ADSCs为B组,单纯接种诱导的血管内皮细胞诱导为C组。三组细胞接种于支架材料后,成脂诱导5~7 d,细胞—支架复合物行油红O染色,反转录-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2（PPARγ-2）的表达,扫描电镜观察支架材料上细胞的生长情况。结果三组细胞在材料上均生长良好。反转录-PCR可检测到A、B两组复合物表达PPARγ-2,C组则无PPARγ-2表达;油红O染色表明成脂诱导后,A、B两组均成功诱导生成大量成熟脂肪样细胞,C组则无脂肪细胞生成,A、B两组和C组支架材料上的脂肪细胞数量差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 h ADSCs成血管内皮细胞诱导分化后与h ADSCs接种于支架材料上共培养,成脂诱导后,能在京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料生成成熟脂肪样细胞。

关键词：脂肪组织工程 Ⅰ型胶原蛋白支架材料京尼平人脂肪间充质干细胞

人脂肪间充质干细胞与脐静脉内皮细胞共培养与丝素蛋白支架联合构建组织工程脂肪的体外研究

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兰州大学学报（医学版） 2015年第4期41卷 1-9页

作者：刘刚强张诚刘毅亢婷王刚兰州军区兰州总医院全军烧伤整形中心甘肃兰州730050

目的探讨人脂肪间充质干细胞(1aADSCs)与人脐静脉内皮细胞(}tUVEC)共培养后,共培养体系与丝索蛋白支架联合构建组织工程脂肪的可行性。方法从人体正常脂肪组织中提取hADCSs,培养并扩增,行成脂及成骨诱导鉴定hADCSs的多向分化特性;流式... 详细信息

目的探讨人脂肪间充质干细胞(1aADSCs)与人脐静脉内皮细胞(}tUVEC)共培养后,共培养体系与丝索蛋白支架联合构建组织工程脂肪的可行性。方法从人体正常脂肪组织中提取hADCSs,培养并扩增,行成脂及成骨诱导鉴定hADCSs的多向分化特性;流式细胞术检测hADCSs表面分子CD34、CD44、CD45、CD90,检测HUVEC表面分子CD31及CD34;测定hADCSs与HUVEC增殖曲线,探讨共培养比例;将共培养体系种植于丝素蛋白支架后行电镜扫描;成脂诱导14d后,反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定成脂基因PPAR叫-2的表达。结果 hADSCs可以向脂肪细胞及成骨细胞分化;流式细胞术检测hADSCs结果显示CD34(+)、CD44(十)、CD45(-)、CD90(-),检测mJVEC结果显示CD31(+)、CD34弱阳性;m5VEC增殖速度快于hADSCs,以HUVEC:hADSCs为1:4比例接种于培养皿培养3 d后,细胞融合时两者比例约为1:1;共培养体系接种于丝素蛋白支架成脂诱导14 d后,通过RT-PCR成功测定出PPAR叫-2基因的表达。结论 hADSCs与HI_YVEC共培养,在体外可成功构建出组织工程脂肪。

关键词：人脂肪间充质干细胞人脐静脉内皮细胞丝素蛋白支架共培养体系组织工程脂肪

人脂肪间充质干细胞条件培养基冻干粉促进皮肤成纤维细胞迁移、细胞外基质合成和抑制巨噬细胞炎症

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中国医药生物技术 2020年第5期15卷 460-468页

作者：陈应炉宋晓乐雷继刚任程洁戴成祥上海赛比曼生物科技有限公司 201210

目的探讨人脂肪间充质干细胞条件培养基冻干粉(hADMSCs-CMLP)对成纤维细胞(HFF-1)迁移、细胞外基质合成水平的影响,以及对小鼠巨噬细胞(Raw264.7)炎症因子释放的影响。方法收集人脂肪间充质干细胞P3代细胞条件培养基上清液,经冷冻干燥后... 详细信息

目的探讨人脂肪间充质干细胞条件培养基冻干粉(hADMSCs-CMLP)对成纤维细胞(HFF-1)迁移、细胞外基质合成水平的影响,以及对小鼠巨噬细胞(Raw264.7)炎症因子释放的影响。方法收集人脂肪间充质干细胞P3代细胞条件培养基上清液,经冷冻干燥后,获得冻干粉制剂。使用前用去离子水溶解,添加到人成纤维细胞HFF-1和小鼠巨噬细胞Raw264.7培养基中。用细胞划痕实验筛选冻干粉的浓度,用活细胞工作站和transwell方法检测人成纤维细胞迁移和细胞增殖情况;qRT-PCR法检测成纤维细胞细胞外基质蛋白纤维粘连蛋白、弹性蛋白、I型胶原蛋白、MMP-1的mRNA水平变化;ELISA法测定巨噬细胞Raw264.7炎症因子TNF-α、IL-6释放情况。结果分离传代培养后,得到的P3代hADMSCs呈长梭形漩涡状并贴壁生长,有立体感,其间充质干细胞表面标志性抗原CD73、CD90、CD105阳性表达率均大于95.00%,CD34、CD45、HLA-DR均小于2.00%;诱导培养21~28 d后出现明显的成脂、成骨和成软骨细胞特性;细胞划痕实验显示50%的hADMSCs条件培养基冻干粉对成纤维细胞划痕修复效果最好。HFF-1细胞与hADMSCs条件培养基冻干粉共培养24 h,HFF-1细胞迁移率增加了近4倍(P细胞纤维粘连蛋白、弹性蛋白、I型胶原蛋白基因表达相对于对照组分别上调了2.07倍(P细胞(Raw264.7)共孵育24 h,与LPS组相比,TNF-α下降了20.7%(P细胞迁移,同时促进成纤维细胞的纤维粘连蛋白、弹性蛋白、I型胶原蛋白转录水平升高;hADMSCs条件培养基冻干粉还能显著抑制TNF-α和IL-6炎性因子的分泌。因此,hADMSCs条件培养基冻干粉在创伤修复、组织工程和美容抗衰领域具有一定应用潜力。

关键词：人脂肪间充质干细胞条件培养基冻干粉细胞因子再生医学

高度同源性人脂肪间充质干细胞体外分离培养条件的优化

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第45期13卷 8861-8864页

作者：杨旭芳何旭张丽红孙梅徐红高云鹤李玉林吉林大学病理生物学教育部重点实验室吉林省长春市130021 牡丹江医学院病理生理教研室黑龙江省牡丹江市157001

背景:目前关于人脂肪间充质干细胞有效分离培养及扩增的方法尚未统一。目的:拟在体外建立人脂肪间充质干细胞的有效分离方法。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-06/12在吉林大学病理生物学教育部重点实验室完成。材料:手术切除... 详细信息

背景:目前关于人脂肪间充质干细胞有效分离培养及扩增的方法尚未统一。目的:拟在体外建立人脂肪间充质干细胞的有效分离方法。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-06/12在吉林大学病理生物学教育部重点实验室完成。材料:手术切除的人腹部脂肪由吉林大学附属医院提供,提供者对实验均知情同意。方法:取腹部脂肪,去除结缔组织和血管,用0.1%Ⅰ型胶原酶37℃振荡消化60min,过滤后离心,将位于最下层的片状沉淀用含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM条件培养基重悬,调整细胞密度至1×109L-1接种于6孔板中,于37℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养,待细胞接近80%～90%融合时消化传代。取P3代细胞,分别进行成骨及成脂肪诱导。主要观察指标:应用激光扫描共聚焦显微镜观察人脂肪间充质干细胞形态学特点;采用流式细胞仪和免疫荧光法检测其免疫学表型、细胞周期、生长曲线;观察其多向分化潜能。结果:分离培养的人脂肪间充质干细胞为成纤维细胞样,呈漩涡状排列。P3代人脂肪间充质干细胞呈CD73,CD105,CD166,CD44及CD29阳性,而CD31,CD34,CD45及HLA-DR阴性;具有典型的干细胞增殖特点,83.81%细胞处于G0/G1期,仅16.19%细胞处于S+G2/M期;细胞在接种后前2d处于生长潜伏期,第3～6天处于对数生长期,第6天达峰值,以后细胞生长速度减慢,进入生长平台期,平均五六天传代1次。成骨诱导2周后,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3d后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性。结论:分离脂肪组织的过程中去除大体可见的血管与结缔组织可减少细胞污染;胶原酶浓度为0.1%和振荡消化时间为60min时,可使基质细胞和脂肪基质纤维成分有效分离,以及使胶原酶与组织得到充分接触,从而获得高度同源性的人脂肪间充质干细胞。

关键词：人脂肪间充质干细胞培养条件优化

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

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江苏大学学报（医学版） 2013年第3期23卷 185-190页

作者：闵敏张雪静马红许辉李遇梅江苏大学附属医院皮肤科江苏镇江212001 镇江市第二人民医院皮肤科江苏镇江212002

目的:建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性。初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制。方法 :剖宫产手术获得腹部皮... 详细信息

目的:建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性。初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制。方法 :剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15%Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养。行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能。通过RT-PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和骨桥蛋白mRNA表达情况。结果 :通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞。MTT法显示细胞增殖能力强。流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA-DR低表达。细胞免疫荧光结果与之相符。hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能。在成骨分化过程中同时伴有成脂发生。RT-PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ-2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义(P细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征。hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用。

关键词：人脂肪间充质干细胞鉴定成骨分化成脂分化