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人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选

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人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选

作者：王致萍厦门大学

学位级别：硕士

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）主要感染人体皮肤和粘膜组织,引起增生性病变甚至恶性肿瘤。高危型别的HPV的长期感染是引发宫颈癌、肛门癌、头颈癌、口咽癌等恶性肿瘤的主要诱因。全球每年约57万宫颈癌新发病例,死亡病例高达... 详细信息

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）主要感染人体皮肤和粘膜组织,引起增生性病变甚至恶性肿瘤。高危型别的HPV的长期感染是引发宫颈癌、肛门癌、头颈癌、口咽癌等恶性肿瘤的主要诱因。全球每年约57万宫颈癌新发病例,死亡病例高达31.1万例。目前宫颈癌的治疗手段有限,手术切除对人体伤害较大且有复发的风险,因此,开展HPV治疗性疫苗的研究刻不容缓。癌蛋白HPV E6和E7在肿瘤发生发展进程中起关键作用,被认为是干预和治疗的关键靶分子,因此对癌蛋白E6和E7的结构和功能展开深入的研究具有十分重要的意义。本研究分别利用原核表达系统和真核表达系统等多途径对HPV E6和E7蛋白的上清可溶性表达进行了探索,最终在pTO-T7载体上取得突破,经过密码子优化、表达菌株、洗脱条件和储存缓冲液等条件的探索和优化,克服了癌蛋白E7在原核表达系统中易聚集沉淀的难题,建立了一套稳定的表达纯化体系,获得了纯度90%以上、均一性和稳定性均良好的HPV18 E7蛋白,并对其展开了单克隆抗体的筛选,共获得55株与HPV18 E7蛋白具有良好反应性的单抗细胞株。本研究进一步对其中26株反应性优良的单抗细胞株展开抗体纯化和性质鉴定工作,包括抗体亚型、抗原抗体反应性、线性及构象和型特异性等。建立了HPV18 E7单抗盘,并且获得了1株反应性良好的型特异性构象抗体9A5、6株反应性良好的型特异性线性抗体（2E8、14E5、17F2、17F3、8A7、5C5、18E7和3B5）、1株反应性较弱的型特异性构象抗体（18E6）、6株两型交叉抗体（1A12、4A10、8E6、17A3、14A6和11E8）和1F6这株六型交叉线性抗体。综上,本研究建立了HPV18致癌蛋白E7可溶性表达和纯化体系,获得了高纯度且性质稳定的HPV18 E7蛋白并建立了单抗盘,为后续开展HPV18 E7蛋白结构解析、功能研究和治疗性疫苗或药物开发奠定了坚实的基础。

关键词：人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7 可溶性表达单克隆抗体

人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

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生物工程学报 2009年第7期25卷 1082-1087页

作者：谢明辉李少伟沈文通李仲艺庄玉娣莫小兵顾颖吴婷张军夏宁邵厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心厦门361005

利用大肠杆菌表达系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,经过纯化和重组装过程获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),研究其免疫原性和诱发中和抗体生成的水平。首先,提取HPV18的基因组DNA,通过PCR扩增获得HPV18 L1基因片段,将其插入pTrx... 详细信息

利用大肠杆菌表达系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,经过纯化和重组装过程获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),研究其免疫原性和诱发中和抗体生成的水平。首先,提取HPV18的基因组DNA,通过PCR扩增获得HPV18 L1基因片段,将其插入pTrxFus表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达HPV18 L1蛋白;其次,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析获得高纯度的HPV18 L1蛋白,而后透析去除预先加入的还原剂DTT,使HPV18 L1蛋白自发组装成VLPs;最后,通过动态光散射技术和透射电子显微镜鉴定HPV18 VLPs的大小和形态,利用假病毒细胞中和实验评价HPV18 VLPs在实验动物体内的免疫原性和中和抗体生成水平。结果表明,HPV18L1蛋白可以在大肠杆菌表达系统中以可溶形式表达,经过纯化的HPV18 L1蛋白可以自发组装成为半径约为29.34nm、与HPV病毒外观相似的VLP。该VLPs在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量为0.006μg,在兔及山羊体内诱导中和抗体滴度高达107。总之,本研究利用原核表达系统可简便高效地获得具有高度免疫原性的HPV18 VLPs,为HPV18预防性疫苗的开发奠定了基础,具有重要的应用意义。

关键词：大肠杆菌表达系统人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒免疫原性中和抗体

人乳头瘤病毒18型L1-E6、E7嵌合基因DNA疫苗的体内免疫效应

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细胞与分子免疫学杂志 2004年第6期20卷 760-763页

作者：李昂杨谨来宝长耿宜萍王艳王一理司履生西安交通大学生命科学与技术学院肿瘤研究所陕西西安710061

目的 :检测HPV 18L1 E6、E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应。方法 :将实验动物BALB/c小鼠 5 4只随机分为 9组 ,按不同免疫方式 (肌肉接种或鼻内滴注 )分别给予不同的重组质粒 (pVAX1 L1 E6M3或pVAX1 L1 E7M3)和免疫佐剂... 详细信息

目的 :检测HPV 18L1 E6、E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应。方法 :将实验动物BALB/c小鼠 5 4只随机分为 9组 ,按不同免疫方式 (肌肉接种或鼻内滴注 )分别给予不同的重组质粒 (pVAX1 L1 E6M3或pVAX1 L1 E7M3)和免疫佐剂 (pLXHDmB7 2或LTB)。用免疫原免疫 3次 ,末次免疫后取眼球后血进行ELISA抗体检测。末次免疫后进行小鼠足垫迟发型超敏反应 (DTH)试验。断足进行小鼠足垫HE染色。取小鼠脾脏制成单细胞悬液 ,进行脾细胞增殖试验 ,并进行CD4 + /CD8+ T细胞中IFN γ+ 或IL 4 + 细胞的FACS分析。结果 :与对照组相比 ,各实验组均获得明显的免疫效果。实验组免疫后血清抗体A值均高于相应组别免疫前 ;肌肉注射组每次免疫后抗体水平较前次明显升高。实验组小鼠注射VLP抗原的左后足垫局部有红肿硬结 ,镜下观察可见大量单核细胞侵润。肌肉接种组的DTH反应强度、脾细胞增殖刺激指数 (SI)和CD8+ IFN γ+ 细胞数均高于鼻内滴注组 ;而鼻内滴注组CD4 + IL 4 + 细胞数高于单纯质粒肌肉接种组 ;加入pLX HDmB7 2的联合免疫组各项指标均高于单纯质粒组。结论 :证实了重组pVAX1 HPV18L1/E6、E7嵌和基因DNA疫苗能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫效应。同时 ,证实B7 2分子能显著提高该质粒在小鼠体内的免疫反应?

关键词：人乳头瘤病毒18型 DNA疫苗免疫效应体内

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

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生物技术通讯 2015年第6期26卷 763-766页

作者：麻粉莲张骞郑丽舒中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052

目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重... 详细信息

目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重组病毒r Bac-L1;PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因,间接免疫荧光法和Western印迹检测L1蛋白的表达。结果:穿梭质粒r Bacmid-L1经PCR鉴定构建正确;感染r Bac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论:利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 L1蛋白。

关键词： L1蛋白人乳头瘤病毒18型杆状病毒 Sf9细胞

人乳头瘤病毒18型类病毒颗粒疫苗研制、中和抗体筛选及冷冻电镜三维结构重建

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人乳头瘤病毒18型类病毒颗粒疫苗研制、中和抗体筛选及冷冻电镜三...

作者：谢明辉厦门大学

学位级别：硕士

高危型人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)病毒感染被认为是引起女性宫颈癌的主要原因。流行病学调查显示98%的宫颈癌都是由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起,其中约70%是由HPV16或HPV18引起。因此,开发一种安全,有效的HPV18疫苗对于预... 详细信息

高危型人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)病毒感染被认为是引起女性宫颈癌的主要原因。流行病学调查显示98%的宫颈癌都是由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起,其中约70%是由HPV16或HPV18引起。因此,开发一种安全,有效的HPV18疫苗对于预防宫颈癌具有重大的意义。首先,本研究构建了高效HPV18L1蛋白大肠杆菌原核表达系统。利用该表达系统,HPV18 L1蛋白能够以可溶性形式表达,保留了其天然的表位。其次,本研究还还针对大肠杆菌来源的HPV18 L1蛋白建立了一套高效,易于放大的纯化工艺,以及类病毒颗粒体外组装工艺。根据该工艺所制备的HPV18VLPs疫苗纯度达到98%以上,各项鉴定指标均符合药典要求。且动物实验显示,该疫苗具有高度的免疫原性,在实验动物体能能诱导高滴度的HPV18中和抗体。本研究在成功制备HPV18 VLPs疫苗的基础上,利用假病毒中和模型,一共鉴定出HPV18中和单抗6株,而后通过阻断实验进一步确定了优势中和单抗11A9以及3C3。为了进一步阐明11A9单抗的中和机制,结合位点,在本研究对HPV18 VLPs进行了冷冻电镜观测,初步了解HPV 18 VLPs的结构模式。此外,还进一步制备了11A9-HPV18 VLPs抗原抗体复合物以备进一步进行冷冻电镜研究。总之,本研究利用大肠杆菌表达系统制备了一种廉价,有效的HPV18 VLP疫苗,对HPV18的中和单抗进行鉴定,并且对于HPV18优势单抗11A9的中和机制,结合位点进行了初步探索,为将来进行HPV18疫苗的分子设计提供了参考。

关键词：大肠杆菌表达系统人乳头瘤病毒18型类病毒颗粒冷冻电镜三维重建技术中和抗体

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达及病毒样颗粒的形成

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微生物学免疫学进展 2014年第5期42卷 11-16页

作者：安静付生芳李雄雄包红寇桂英白幕群余黎兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程研究中心甘肃兰州730046

目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基... 详细信息

目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基因,构建重组表达载体PET30a-L1,通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白,其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后,获得高纯度的的L1蛋白,再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达,纯化后的蛋白纯度达到90%以上,电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白,并获得均一的VLPs颗粒,为疫苗的开发奠定基础。

关键词：大肠埃希菌表达系统人乳头瘤病毒18型 L1蛋白优化可溶性表达病毒样颗粒

人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

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细胞与分子免疫学杂志 2002年第6期18卷 558-561页

作者：李昂郑瑾来宝长耿宜萍王艳王一理司履生西安交通大学生命科学与技术学院肿瘤研究所陕西西安710061

目的　构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法　克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基... 详细信息

目的　构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法　克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基因连接后插入真核表达载体 pVAX1,构建真核表达质粒 pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法 ,转染CHO细胞 ,以抗HPV 18L1、抗E6和抗E7特异性单克隆抗体 (mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果　ELISA检测显示 ,转染各种pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P N值均 >2 .1;免疫细胞化学检测 ,在胞浆、胞核可见棕黄色颗粒。结论　所构建的 pVAX1 L1E6Mxx E7Mxx融合蛋白表达质粒 ,可在转染细胞内表达相应的L1 E6Mxx和L1 E7Mxx蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。

关键词： L1-E6 L1-E7 人乳头瘤病毒18型表达载体定点突变

利用假病毒法检测重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗的免疫原性

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免疫学杂志 2014年第8期30卷 731-736页

作者：周朝明陈露马文艺上海泽润生物科技有限公司质量研究部 201203

目的建立并验证重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗中和滴度的检测方法 ,并且利用此假病毒法进行免疫原性研究。方法建立并优化以ZsGreen假病毒为基础的中和实验(ZsGreen法)测定血清中和滴度,比较荧光显微镜观察与微流式细胞分析法、流... 详细信息

目的建立并验证重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗中和滴度的检测方法 ,并且利用此假病毒法进行免疫原性研究。方法建立并优化以ZsGreen假病毒为基础的中和实验(ZsGreen法)测定血清中和滴度,比较荧光显微镜观察与微流式细胞分析法、流式细胞分析法的差异,并对专属性、精密度、耐用性、假病毒稳定性和不同细胞代次的影响进行了方法学验证。结果ZsGreen法的HPV16/18假病毒最佳接种量为1 600 TCID50,HPV16型与HPV18型无交叉,具有良好的专属性和精密度,采用不同细胞代次与不同批次假病毒进行检测,均能获得较好的重复性。结论 ZsGreen法假病毒中和滴度检测法准确可靠、重复性好,经方法学验证后此法适用于疫苗的免疫原性研究。

关键词：人乳头瘤病毒16型人乳头瘤病毒18型假病毒 ZsGreen 中和滴度

Biacore法测定重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗原液的动力学常数

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药物分析杂志 2014年第2期34卷 215-220页

作者：周朝明上海泽润生物科技有限公司上海201203

目的：建立Biacore法测定重组人乳头瘤病毒双价（16/18型）疫苗原液的动力学常数。方法：分别将HPV 16·V5中和单抗与HPV 18·J4中和单抗偶联到CM5芯片上，然后根据Biacore X-100 Kinetics/Affinity控制软件将 HPV 16L1和HPV 18L1原液... 详细信息

目的：建立Biacore法测定重组人乳头瘤病毒双价（16/18型）疫苗原液的动力学常数。方法：分别将HPV 16·V5中和单抗与HPV 18·J4中和单抗偶联到CM5芯片上，然后根据Biacore X-100 Kinetics/Affinity控制软件将 HPV 16L1和HPV 18L1原液分别稀释至适当的不同浓度，采用50 mmol·L^-1 氢氧化钠溶液作为再生液进行动力学分析。根据Biacore X-100 Evaluation分析软件进行拟合，得到样品的动力学常数KD值。结果：Biacore法测定重组人乳头瘤病毒16型、18型原液动力学常数KD分别为4.844×10^-10 mol·L^-1和1.67×10^-10 mol·L^-1，HPV 16L1和HPV 18L1原液在浓度为0.625-40 μg·mL^-1时线性关系良好（HPV16L1：Y=17.77X-0.0184，r=1.000；HPV 18L1：Y=18.73X＋5.282，r=0.9957）。HPV 16L1和HPV 18L1原液精密度和稳定性试验的RSD均〈20%。并且Biacore法测定的结合常数ka值和体外相对效力测定（IVRP法）的EC50值之间具有一定的相关性。结论：该方法实时、简便、快速、准确、灵敏，适用于重组人乳头瘤病毒原液的动力学分析。

关键词：人乳头瘤病毒16型人乳头瘤病毒18型动力学常数 Biacore 表面等离子共振体外相对效力测定