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人β-防御素3转染脂肪干细胞成骨分化潜能及抗牙周炎致病菌的作用

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实用临床医药杂志 2022年第12期26卷 4-9页

作者：蒋莉莉张艳东胡硕红河北省张家口宣钢医院口腔科河北张家口075100 河北北方学院附属第二医院重症科河北张家口075100 海南省海口市总医院口腔科海南海口570100

目的探讨人β-防御素3(hβD-3)转染脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化潜能及体外抗牙周炎致病菌的作用。方法体外提取人腹部脂肪组织,分离后用流式细胞仪鉴定人脂肪干细胞(hADSCs)免疫表型(CD29/CD44),体外培养hADSCs,将细胞分为对照组、空载... 详细信息

目的探讨人β-防御素3(hβD-3)转染脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化潜能及体外抗牙周炎致病菌的作用。方法体外提取人腹部脂肪组织,分离后用流式细胞仪鉴定人脂肪干细胞(hADSCs)免疫表型(CD29/CD44),体外培养hADSCs,将细胞分为对照组、空载组与实验组(按hβD-3-hADSCs接种密度分为低密度组、中密度组和高密度组),对照组不作处理,空载组转染不含hβD-3基因的慢病毒载体,实验组利用质粒构建含hβD-3基因的慢病毒载体并转染hADSCs。空载组与实验组均加入成骨分化诱导液,对照组不作处理,在诱导7、14 d后,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测3组细胞中成骨相关基因[碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ-型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)]的表达量,以评价hADSCs的分化能力。测量抑菌圈的直径,设置抗生素阳性对照(米诺环素组、环丙沙星组),检测转染后的hADSCs对牙周致病菌葡萄球菌、卟啉单胞菌的抑菌活性。结果诱导7、14 d时,空载组与实验组的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相对表达量均高于对照组,差异有统计学意义(P素组与环丙沙星组,中密度组抑菌圈大于环丙沙星组,高密度组抑菌圈大于米诺环素组与环丙沙星组,差异有统计学意义(P素组与环丙沙星组,中密度组抑菌圈大于米诺环素组,高密度组抑菌圈大于米诺环素组与环丙沙星组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论hβD-3转染可促进hADSCs成骨分化,且对牙周致病菌葡萄球菌、卟啉单胞菌均有较好的抗菌活性。

关键词：人β-防御素3 脂肪干细胞成骨分化牙周炎致病菌

人β-防御素3与结缔组织生长因子共表达重组慢病毒载体的构建及表达

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军事医学 2017年第1期41卷 38-42页

作者：孙洁钱智勇刘静张欣然刘翠刘东华郭红延郭希民北京武警总医院口腔医学中心北京100039 军事医学科学院基础医学研究所北京100850

目的体外构建共表达人β-防御素3(hBD3)与结缔组织生长因子(CTGF)的重组慢病毒,并检测其对骨髓间充质干细胞(BMSC)的转染效率及表达情况。方法体外构建携带hBD3、CTGF和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒表达载体,测定病毒滴度。... 详细信息

目的体外构建共表达人β-防御素3(hBD3)与结缔组织生长因子(CTGF)的重组慢病毒,并检测其对骨髓间充质干细胞(BMSC)的转染效率及表达情况。方法体外构建携带hBD3、CTGF和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒表达载体,测定病毒滴度。转染BMSC,确定最适感染倍数(MOI)值。采用荧光显微镜和流式细胞仪检测病毒的转染效率及传代稳定性。Western印迹检测目的蛋白的表达。结果经PCR和测序分析鉴定,成功构建了携带hBD3和CTGF基因的重组慢病毒载体Lenti-CTGF-hBD3-EGFP、Lenti-hBD3-EGFP和Lenti-EGFP,检测病毒滴度分别为3.21×10~8、5.80×10~8和1.16×10~9。病毒转染BMSC最适MOI值为150。荧光显微镜下,转染后BMSC绿色荧光效率高;流式细胞仪检测病毒的转染效率,Lenti-CTGF-hBD3-EGFP为79.72%,Lenti-hBD3-EGFP为83.08%,Lenti-EGFP为84.43%,且都稳定遗传。Western印迹显示目的蛋白表达成功。结论成功构建了共表达hBD3、CTGF的重组慢病毒载体,并能在BMSC中高效、稳定表达,为进一步研究hBD3与CTGF的应用奠定了基础。

关键词：重组慢病毒人β-防御素3 结缔组织生长因子骨髓间充质干细胞

人β-防御素3与杀菌/通透性增加蛋白重组腺病毒载体及其转染C3H10T1/2细胞的构建

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中国现代医学杂志 2015年第20期25卷 17-22页

作者：张欣然刘翠钱智勇翟羽郭希民郭红延辽宁医学院北京武警总医院研究生培养基地北京100039 北京武警总医院口腔医学中心北京100039 军事医学科学院基础医学研究所(全军干细胞与再生医学重点实验室) 北京100850

目的构建人β-防御素3(h BD3)与杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的重组腺病毒载体p Adxsi-BPIBD3,并转染鼠胚胎间充质干细胞系(C3H10T1/2),观察融合蛋白的表达。方法酶切原始质粒,得到BPI-BD3片段,连接到p Shuttle-CMV得到p Shuttle-BPI-BD3,... 详细信息

目的构建人β-防御素3(h BD3)与杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的重组腺病毒载体p Adxsi-BPIBD3,并转染鼠胚胎间充质干细胞系(C3H10T1/2),观察融合蛋白的表达。方法酶切原始质粒,得到BPI-BD3片段,连接到p Shuttle-CMV得到p Shuttle-BPI-BD3,验证后将插入片段转移至p Adxsi载体构建重组腺病毒质粒,线性化后转染HEK293细胞,扩增纯化后,TCID50测定重组腺病毒滴液。p Adxsi-BPI-BD3及空载体p Adxsi(作为对照组)转染C3H10T1/2。RT-PCR、Western blot检测BPI-BD的表达;MTT法检测其对细胞增殖的影响。结果成功构建重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3,纯化后病毒滴度达1.2×1010pfu/ml。p AdxsiBPI-BD3转染C3H10T1/2后,RT-PCR、Western blot结果显示,BPI-BD3融合蛋白表达成功。MTT结果显示,转染的C3H10T1/2生长无明显影响(P>0.05)。结论成功构建重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3,且转染C3H10T1/2后可稳定表达BPI-BD3融合蛋白,为进一步研究应用抗菌肽BPI-BD3奠定基础。

关键词：腺病毒载体人β-防御素3 杀菌/通透性增加蛋白

人β-防御素3基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

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现代食品科技 2012年第9期28卷 1123-1127页

作者：吴晖陈艺肖俊梅唐语谦华南理工大学轻工与食品学院广东广州510640

以质粒pPIC9K-hBD3为模板,扩增得到一段上游带信号肽因子(α-factor)的人β-防御素-3(hBD-3)基因,克隆至酿酒酵母穿梭质粒pYES2中,构建了酿酒酵母表达载体pYES2-α-factor-hBD3(pYα-hBD3)。将重组质粒转化至Saccharomyces cerevisiaeINVSC1中,鉴定阳性重组子,经2%半乳糖诱导表达。实验发现表达所得hBD-3对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(ATCC10231)具有明显的抑菌活性。hBD-3基因片段在酿酒酵母中的表达,为进一步探讨hBD-3的生物活性及防御素应用安全性打下基础。

关键词：人β-防御素3 酿酒酵母分泌表达生物活性

人β-防御素3基因的克隆分析及其真核表达载体的构建

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中国农学通报 2012年第5期28卷 19-22页

作者：黄仙仙徐婷婷徐雪丽赵卫东郑振宇李春丽河南农业大学生命科学学院郑州450002 河南农业大学牧医工程学院郑州450002

根据Genebank上公布的人β-防御素3基因序列设计引物,以提取的人DNA为模板进行PCR扩增,得到全长为1391bp的人β-防御素3完整基因组序列,包括起始序列、信号肽序列、2个外显子、1个内含子以及上下游酶切位点和终止密码子等。与NCBI上公布... 详细信息

根据Genebank上公布的人β-防御素3基因序列设计引物,以提取的人DNA为模板进行PCR扩增,得到全长为1391bp的人β-防御素3完整基因组序列,包括起始序列、信号肽序列、2个外显子、1个内含子以及上下游酶切位点和终止密码子等。与NCBI上公布的DNA序列的同源性达到99.93%,在内含子上有1个A的缺失,其编码氨基酸序列与公布序列的同源性达100%。将其克隆到pMD18-T载体中,进一步构建了其真核表达载体pcDNA-hBD3,为其表达和功能研究奠定基础。

关键词：人β-防御素3 克隆真核表达载体

影响人β-防御素3转基因克隆山羊生产的受体因素及后代外源基因的整合检测

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影响人β-防御素3转基因克隆山羊生产的受体因素及后代外源基因的...

作者：李亮亮西北农林科技大学

学位级别：硕士

利用体细胞核移植技术生产转基因动物在畜牧业生产和生物医学领域具有重要的应用价值,然而体细胞核移植技术的总体效率仍然较低。为了提高转人β-防御素3（humanβdefension 3, hBD3）基因克隆奶山羊的生产效率,本研究比较了不同受体品... 详细信息

利用体细胞核移植技术生产转基因动物在畜牧业生产和生物医学领域具有重要的应用价值,然而体细胞核移植技术的总体效率仍然较低。为了提高转人β-防御素3（humanβdefension 3, hBD3）基因克隆奶山羊的生产效率,本研究比较了不同受体品种、受体发情时间与转基因克隆胚胎激活时间的同步化、受体排卵情况和排卵数对转hBD3基因克隆胚胎移植受体妊娠率的影响;运用分子生物学方法对转基因子代羊与供体细胞及产羔受体的亲缘关系进行了鉴定;并通过对转基因子代羊外源基因整合位点和拷贝数检测,确定了转基因克隆羊外源基因整合效率,为进一步进行转基因克隆羊的生产研究奠定了基础。 1.影响人β-防御素3转基因克隆山羊生产的胚胎移植受体因素本研究比较了不同受体品种（西农萨能奶山羊和波尔山羊）、受体发情时间与转基因克隆胚胎激活时间的同步化、受体排卵情况和排卵数对转hBD3基因克隆胚胎移植受体妊娠率的影响。共移植受体64只,移植后30天B超检查受体妊娠率为34.4%（22/64）,其中12只在妊娠过程中流产,妊娠到期产羔受体数为10只,产羔受体率为15.6%（10/64）,共产羔14只。其中:（1）西农萨能奶山羊受体与波尔山羊受体妊娠率差异不显著（30.6% vs. 46.7%, P＞0.05）;（2）受体发情时间与转基因克隆胚胎激活时间同步化为0天（同一天）组与-1天组（受体发情时间比克隆胚胎激活时间早1天）或+1天组（受体发情时间比克隆胚胎激活时间晚1天）,受体妊娠率差异显著（53.6% vs. 18.8% or 25%, P＜0.05）,-1天组与1天组的妊娠率差异不显著（18.8% vs. 25%, P＞0.05）;（3）受体排卵情况对受体妊娠率的影响:转基因克隆胚胎移植时卵巢上大卵泡组受体与刚排卵组受体或已排卵组受体之间差异显著（6.7% vs. 40.9% or 44.4%, P＜0.05）,刚排卵组受体与已排卵组受体之间差异不显著（40.9% vs. 44.4%, P＞0.05）;（4）受体排卵数为1组与≥2组的受体,受体妊娠率差异不显著（33.3% vs. 48.4%, P＞0.05）。 2.转基因克隆羊与供体细胞及产羔受体的亲缘关系鉴定利用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测转基因克隆子代羊与供体细胞及产羔受体的亲缘关系。结果显示,所检测转基因克隆子代羊遗传物质均来源于转基因供体细胞,与产羔受体没有亲缘关系。 3.转基因克隆羊外源基因整合检测转基因克隆羊外源基因整合检测结果为:（1）多重PCR检测转基因克隆子代羊的外源基因整合情况,结果显示,转基因子代羊基因组内整合了hBD3基因和neo基因（抗性基因）;（2）Southern杂交检测外源基因的拷贝数,结果显示,hBD3基因以低拷贝形式整合到转基因克隆子代羊基因组内;（3）热不对称交错PCR检测外源基因的整合位点,结果显示,hBD3基因整合到转基因子代羊的4号染色体上。研究结果表明,在进行转基因克隆胚胎移植时,应选择发情时间与转基因体细胞核移植克隆胚胎激活时间同步化,且已经排卵的受体;所检测的转基因克隆子代羊均来源于转基因供体细胞,与产羔受体没有亲缘关系;所检测转基因克隆子代羊均为转hBD3基因山羊。

关键词：人β-防御素3 转基因克隆动物奶山羊

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响

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微生物学通报 2006年第6期33卷 84-88页

作者：李春丽席燕燕陈正华何国庆河南农业大学牧医工程学院浙江大学生物系统工程与食品科学学院杭州310019 甘肃亚盛集团博士后科研工作站北京分站浙江大学生物系统工程与食品科学学院

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用(P0.05),延长诱导时间对菌株生长有利(P0.05)。以0.5%乳糖... 详细信息

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用(P0.05),延长诱导时间对菌株生长有利(P0.05)。以0.5%乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28.1%。控制好诱导条件,乳糖与IPTG的诱导效果基本相当。

关键词：人β-防御素3 大肠杆菌重组表达优化

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人β-防御素3在感染皮肤组织中表达的研究

军事医学科学院院刊 2007年第1期31卷 36-38页

作者：庹晓晔柴家科冯瑞盛志勇解放军总医院第一附属医院烧伤整形科北京100037

目的:探讨人β-防御素3(hum an β-defensin 3,hBD3)在感染皮肤组织中的表达情况。方法:取烧伤患者感染皮肤组织和正常皮肤组织,提取总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western印迹法检测hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论:感染皮肤组织中h... 详细信息

目的:探讨人β-防御素3(hum an β-defensin 3,hBD3)在感染皮肤组织中的表达情况。方法:取烧伤患者感染皮肤组织和正常皮肤组织,提取总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western印迹法检测hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论:感染皮肤组织中hBD3的mRNA和蛋白水平均显著高于正常皮肤组织。感染皮肤组织中hBD3表达增强。

关键词：人β-防御素3 皮肤感染表达

人β-防御素3的cDNA克隆和表达载体的构建

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第三军医大学学报 2003年第7期25卷 617-619页

作者：陈姗董燕麟何凤田李蓉芬高会广陈敏彭家和第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室重庆400038

目的　克隆人 β 防御素 3 (hβD 3 )cDNA并构建其原核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。方法　从人扁桃体组织中提取总RNA ,经RT PCR扩增编码hβD 3成熟肽的cDNA序列 ,将其克隆至pUC18载体进行序列测... 详细信息

目的　克隆人 β 防御素 3 (hβD 3 )cDNA并构建其原核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。方法　从人扁桃体组织中提取总RNA ,经RT PCR扩增编码hβD 3成熟肽的cDNA序列 ,将其克隆至pUC18载体进行序列测定 ,然后构建于新型原核表达载体pQE 80L中。结果　RT PCR扩增得到约 13 5bp的目的DNA片断 ,序列分析与GenBank中报道的编码hβD 3成熟肽的cDNA序列完全一致。结论　hβD 3cDNA的克隆和原核表达载体的构建 ,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。

关键词：抗菌肽人β-防御素3 基因克隆