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COL1A1基因在贵州黑山羊性腺轴中的表达及其对产羔相关基因的影响

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农业生物技术学报 2022年第11期30卷 2152-2162页

作者：周明帅温晓艳张艳李永徐畅杨秀远赵佳福贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/动物科学学院

型胶原蛋白α1链(collagen typeⅠα1 chain, COL1A1)作为Ⅰ型胶原蛋白的重要组成成分，在参与调控卵泡发育及卵巢细胞增殖中发挥作用，与动物繁殖性状密切相关。为探究COL1A1基因与贵州黑山羊(Capra hircus)繁殖力间的关系，及其不同... 详细信息

型胶原蛋白α1链(collagen typeⅠα1 chain, COL1A1)作为Ⅰ型胶原蛋白的重要组成成分，在参与调控卵泡发育及卵巢细胞增殖中发挥作用，与动物繁殖性状密切相关。为探究COL1A1基因与贵州黑山羊(Capra hircus)繁殖力间的关系，及其不同表达水平对产羔相关基因的影响，本研究采集单羔、多羔贵州黑山羊性腺轴组织(子宫,卵巢,垂体,下丘脑,输卵管)，采用qPCR检测COL1A1基因在单羔、多羔山羊性腺轴中的表达水平，随后分离培养卵巢颗粒细胞；通过RNA干扰技术，构建目的基因的干扰载体，并转染至卵巢颗粒细胞中，使用qPCR及Western blot方法检测COL1A1基因及其蛋白的表达量，筛选最佳干扰组，再通过qPCR方法检测干扰COL1A1基因后对产羔相关基因骨形态发生蛋白15 (bone morphogenetic protein 15, BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B (bone morphogenetic protein receptor 1B, BMPR-1B)、生长分化因子9 (growth differentiation factor 9, GDF9)和促卵泡激素β亚基(follicle stimulating hormone β-subunit,FSHβ)表达的影响。结果表明，COL1A1基因在单羔和多羔子宫、卵巢、垂体、下丘脑和输卵管组织中均有表达。其中在多羔组卵巢、下丘脑中表达量最高，且极显著高于单羔组(P产羔相关基因BMP15、BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量均极显著低于shRNA-NC组(P产羔相关基因的抑制，说明COL1A1基因与卵巢发育及卵泡生长密切相关，可作为贵州黑山羊多羔品系选育的候选基因。

关键词： COL1A1基因贵州黑山羊性腺轴卵巢颗粒细胞产羔性状

藏羊BMPR-ⅠA基因多态性及其与产羔性状关联分析

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畜牧与兽医 2022年第6期54卷 18-22页

作者：李明明吴庆伟邓玉婷靳生伟张军霞青海大学农牧学院青海西宁810016

为研究骨形态发生蛋白受体-ⅠA(bone morphogenetic protein receptorⅠA,BMPR-ⅠA)基因多态性对藏羊(Tibetan sheep)繁殖性能的遗传效应,以403只产单羔藏羊母羊和30只产双羔藏羊母羊为研究对象,采用多重高温连接酶检测反应技术(improve... 详细信息

为研究骨形态发生蛋白受体-ⅠA(bone morphogenetic protein receptorⅠA,BMPR-ⅠA)基因多态性对藏羊(Tibetan sheep)繁殖性能的遗传效应,以403只产单羔藏羊母羊和30只产双羔藏羊母羊为研究对象,采用多重高温连接酶检测反应技术(improved multiple ligase detection reaction,iMLDR)对BMPR-ⅠA基因两个SNPs在藏羊群体中的多态性进行检测及其与产羔数进行关联分析。结果显示:在BMPR-ⅠA基因第8和第9外显子上检测到g.136901G>A和g.139032G>A两个同义突变位点。在g.136901G>A和g.139032G>A突变位点上均检测到GG、GA和AA三种基因型,其优势基因型均为GG,优势等位基因均为G;藏羊群体处于低度多态(PICA和g.139032G>A两个突变位点均处于哈迪-温伯格平衡状态。连锁不平衡分析发现,两个位点之间连锁不紧密。关联性分析结果发现,g.136901G>A和g.139032G>A两个突变位点与藏羊平均产羔数均无显著相关性(P>0.05),在g.136901G>A突变位点上,突变型平均产羔数高于野生型,但差异不显著(P>0.05)。上述结果初步表明,BMPR-ⅠA基因g.136901G>A突变位点对藏羊产羔数有一定潜在影响。

关键词： BMPR-ⅠA基因 SNP 产羔性状藏羊

努比亚黑山羊繁殖相关基因多态性与产羔性状的关联分析

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努比亚黑山羊繁殖相关基因多态性与产羔性状的关联分析

作者：胡艳广西大学

学位级别：硕士

山羊的产羔性状遗传力低,采用传统的育种方法周期长,选育进度缓慢,而分子标记辅助选择(MAS)可以提高选种的准确性和缩短世代间隔。本研究基于完整的产羔数据的基础上,先进行非遗传因素(气温、场次、胎次)与产羔性状之间的相关性的研究;... 详细信息

山羊的产羔性状遗传力低,采用传统的育种方法周期长,选育进度缓慢,而分子标记辅助选择(MAS)可以提高选种的准确性和缩短世代间隔。本研究基于完整的产羔数据的基础上,先进行非遗传因素(气温、场次、胎次)与产羔性状之间的相关性的研究;然后利用DNA池、多重PCR和二代测序相结合的方法对10个与繁殖性能相关的候选基因进行单核苷酸(SNPs)筛选及基因型的鉴定;最后将这些筛选的SNPs位点做遗传学分析及其与产羔性状关联分析,为山羊产羔性状的选育提供新的分子标记。研究结果如下:1、母羊的产羔性状(产羔数、初生重、断奶重)在适宜的温度下比高温热应激的要好,建议在10-11月份进行集中配种,有利于提高山羊的繁殖力;不同场次对产羔性能也有一定的影响;不同胎次对母羊产羔性状有显著影响(P产羔数与初生重、断奶重呈负相关,初生重与断奶重呈正相关。2、采用DNA混合池和多重PCR重测序,在10个候选基因中,检测出52个SNPs,其中11个SNPs的PIC值小于0.25,属于低度多态,其余41个SNPs的PIC值处于0.25产羔数关联分析发现有4个、6个、6个和1个SNPs分别与第一胎产羔数,第二胎产羔数、第三胎产羔数、三胎联合产羔数存在显著关联(PT位点突变可使第19位的苏氨酸(Thr)变为丝氨酸(Ser),rs665524423G>C位点可以使第28位的甘氨酸(Gly)变为精氨酸(Arg),碱基置换可能改变了NOBOX蛋白的理化性质,进而影响山羊的繁殖性能。同时,对SYCP1和MFGE8基因的5’端突变位点转录因子预测发现,突变前后存在差异结合的转录因子,可能影响了这两个基因的表达。本研究从10个候选基因中筛选出一些与努比亚黑山羊产羔性状密切相关的SNPs,为建立山羊MAS技术打下基础,为选育高繁殖力的努比亚黑山羊种群提供技术支持。

关键词：努比亚黑山羊 SNP 产羔性状遗传分析关联分析

超表达SRD5A2基因对山羊卵巢颗粒细胞增殖和产羔相关基因表达的影响

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中国兽医学报 2021年第8期41卷 1620-1626,1633页

作者：洪磊陈祥唐文周志楠贵州大学动物科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州贵阳550025

旨在探究类固醇5α还原酶2(SRD5A2)基因对卵巢颗粒细胞增殖和山羊产羔性状相关基因表达的影响。选取健康黔北麻羊母羊6只,采集卵巢组织进行卵巢颗粒细胞培养及提取组织中的总RNA反转录为cDNA,克隆黔北麻羊SRD5A2基因CDS区全长序列,进一... 详细信息

旨在探究类固醇5α还原酶2(SRD5A2)基因对卵巢颗粒细胞增殖和山羊产羔性状相关基因表达的影响。选取健康黔北麻羊母羊6只,采集卵巢组织进行卵巢颗粒细胞培养及提取组织中的总RNA反转录为cDNA,克隆黔北麻羊SRD5A2基因CDS区全长序列,进一步构建SRD5A2基因真核表达载体,转染至卵巢颗粒细胞。采用免疫荧光法鉴定培养细胞为卵巢颗粒细胞,CCK-8法检测细胞增殖情况,RT-qPCR检测SRD5A2、BMP15、GDF9、BMPR-1B和FSHB的mRNA表达水平。CCK-8结果发现,超表达SRD5A2基因在6,12,24 h显著促进细胞增殖(P产羔性状相关GDF9基因mRNA表达水平显著高于空白对照组(P产羔相关基因BMPR-1B、BMP15、GDF9、FSHB在卵巢颗粒细胞表达。本研究成功克隆黔北麻羊SRD5A2基因编码区,构建pEGFP-N3-SRD5A2真核表达载体,并成功在卵巢颗粒细胞中表达,检测SRD5A2基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞增殖及产羔性状相关基因表达的影响,为进一步研究SRD5A2基因对黔北麻羊产羔性状影响提供基础。

关键词：黔北麻羊 SRD5A2 卵巢颗粒细胞细胞增殖产羔性状

CTSD对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制及功能分析

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畜牧兽医学报 2021年第5期52卷 1278-1292页

作者：周志楠陈祥张艳杨沛方惠茂茂唐文洪磊贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵阳550025

旨在分析组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制并初步探究其对产羔性状的影响机理。本研究以36周龄、健康、多胎黔北麻羊母羊(n=5)为研究对象,屠宰后采集卵巢组织分离培养卵泡颗粒细胞,构建真核表达载体pEGFP... 详细信息

旨在分析组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制并初步探究其对产羔性状的影响机理。本研究以36周龄、健康、多胎黔北麻羊母羊(n=5)为研究对象,屠宰后采集卵巢组织分离培养卵泡颗粒细胞,构建真核表达载体pEGFP-N3-CTSD,将其导入细胞后在转录与翻译水平验证真核表达效率;通过CCK-8法检测在不同时间段内重组质粒对颗粒细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测重组质粒对颗粒细胞凋亡及周期的影响;随后使用RT-qPCR法在细胞水平检测重组质粒对细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3,细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E mRNA表达水平的影响,最后,以多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA为功能基因,在转录与翻译水平上验证重组质粒对其mRNA与蛋白表达的影响。双酶切及测序结果证实,黔北麻羊CTSD基因真核表达载体pEGFP-N3-CTSD构建成功,且在转录与翻译水平极显著上调CTSD在颗粒细胞中的表达(P性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA在转录和翻译水平中的表达(P性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA的表达量(P性状候选基因的表达进而间接的成为影响山羊产羔性状的重要因子,本研究为进一步探明CTSD对山羊产羔性状调控机理及对颗粒细胞的影响机制奠定基础。

关键词： CTSD 黔北麻羊颗粒细胞调控机制产羔性状

不同产羔数燕山绒山羊卵巢组织差异表达基因的筛选与分析

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不同产羔数燕山绒山羊卵巢组织差异表达基因的筛选与分析

作者：张天浩河北科技师范学院

学位级别：硕士

燕山绒山羊是河北省青龙地区一种独特的生物资源,具有产绒量高、羊肉品质好、抗病力和适应性强等优点,2021年正式被确定为国家畜禽遗传资源。自然条件下该山羊每胎以产单羔为主,少数母羊可产双羔。目前对其繁殖性能调控机理知之甚少,为... 详细信息

燕山绒山羊是河北省青龙地区一种独特的生物资源,具有产绒量高、羊肉品质好、抗病力和适应性强等优点,2021年正式被确定为国家畜禽遗传资源。自然条件下该山羊每胎以产单羔为主,少数母羊可产双羔。目前对其繁殖性能调控机理知之甚少,为了解其调控机制,提高每胎产羔数量,继而促进当地绒山羊产业的发展,本研究以2～4岁发情期的单、双羔母羊卵巢为试验材料,通过转录组测序（RNA-Seq）、荧光定量PCR（q RT-PCR）等技术探究了该山羊发情期卵巢中基因的表达模式。具体如下:1.利用RNA-seq技术,构建了单、双羔燕山绒山羊6个卵巢组织文库,共发现306个差异表达基因,双羔组相对于单羔组上调表达基因98个,下调表达基因208个。对差异表达基因进行了功能注释,GO分析发现大量差异表达基因富集到卵泡发育相关的生物学过程中,包括卵母细胞发育、卵泡发育、胚胎发育的调控和生殖细胞发育等;KEGG分析发现一些差异表达基因参与到与繁殖过程相关通路中,包括松弛素信号通路、c AMP信号通路、TGF-beta信号通路、MAPK信号通路和雌激素信号通路等。随机挑选出5个差异表达基因进行了q RT-PCR的验证,结果与转录组数据一致。经分析最后筛选出9个重点候选基因（ADAMTS16、GABRA1、TIMP3、TRPC1、SOS2、WNT2、SLC6A3、PRLHR和SERPINB11）,对其中3个基因进行了功能验证,初步确定这3个基因是调控燕山绒山羊繁殖性能（产羔性状）的功能基因。2.为进一步明确初筛差异表达基因与燕山绒山羊繁殖性能的关系,利用q RT-PCR技术对差异倍数最大的2个基因ADAMTS16和SERPINB11进行了单、双羔母羊心、肝、脾、肺、肾、卵巢、子宫、输卵管、小肠和肌肉组织表达谱分析,结果发现,二者存在明显组织特异性,ADAMTS16基因在双羔母羊卵巢组织中表达量最高,其次是子宫,表明对燕山绒山羊的双羔性状发挥了一定作用;SERPINB11基因在单羔母羊卵巢组织中表达量最高,其次是子宫和输卵管,表明对燕山绒山羊单羔的形成有一定作用。3.对山羊、绵羊、牛、猪、家犬和家鼠6个物种的ADAMTS16和SERPINB11基因进行了生物信息学分析,包括同源性分析、跨膜结构、信号肽、疏水性、一级结构和二级结构的预测等。结果发现山羊和绵羊的遗传亲缘关系最近,蛋白质结构也最相似,其他物种间虽有不同程度的差异,其蛋白结构基本相同,并且山羊ADAMTS16和SERPINB11蛋白均无跨膜结构,表明这两个基因高度保守且没有复杂的空间结构。

关键词：燕山绒山羊卵巢产羔性状转录组测序

黔北麻羊SRD5A2基因干扰载体构建及其对产羔相关基因表达的影响

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畜牧兽医学报 2020年第12期51卷 2980-2990页

作者：洪磊陈祥唐文周志楠段志强赵佳福贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点试验室贵州省动物遗传育种与繁殖重点试验室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵阳550025

旨在探究SRD5 A2基因对山羊产羔性状相关基因表达的影响。本研究选择健康的(2~3岁)黔北麻羊经产母羊3只,体重约32 kg,采集卵巢组织并成功培养卵巢颗粒细胞。通过在线软件设计SRD 5A2基因的4对siRNA干扰序列和1对阴性对照序列,连接pGPH1/... 详细信息

旨在探究SRD5 A2基因对山羊产羔性状相关基因表达的影响。本研究选择健康的(2~3岁)黔北麻羊经产母羊3只,体重约32 kg,采集卵巢组织并成功培养卵巢颗粒细胞。通过在线软件设计SRD 5A2基因的4对siRNA干扰序列和1对阴性对照序列,连接pGPH1/GFP/Neo载体后,将构建成功的干扰载体转染至黔北麻羊卵巢颗粒细胞。利用qRT-PCR方法筛选出干扰效率最佳的载体,检测其对SRD 5A2基因表达的影响。运用qRT-PCR检测沉默SRD 5A2基因对山羊产羔性状相关基因骨形态发生蛋白15(BMP 15)、生长分化因子9(GDF 9)、骨形态发生蛋白1B(BMPR-1B)和卵泡刺激素β亚基(FSHβ)表达的影响。结果表明,本试验在培养黔北麻羊卵巢颗粒细胞的基础上,成功构建了黔北麻羊SRD 5A2基因的干扰载体,并筛选出shRNA-SRD5A2-1干扰效果最佳(P产羔性状相关基因BMP 15、BMPR-1B、GDF 9和FSHβ的表达量均显著降低,BMP 15的表达量极显著低于shRNA-NC对照组(P产羔性状相关基因的表达,提示SRD 5A2基因与黔北麻羊产羔性状密切相关,本试验结果为进一步研究SRD 5A2基因对黔北麻羊产羔性状的调控机制提供了基础。

关键词：黔北麻羊 SRD5 A2基因 RNA干扰卵巢颗粒细胞产羔性状

努比亚山羊BMPR-IB基因多态性与其产羔性状的关联分析

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南方农业学报 2019年第4期50卷 860-866页

作者：邹辉瞿秋红夏琴崔悦悦江雨航韦玲静严雪瑜蒋钦杨韦英明广西大学动物科学技术学院南宁530004 广西水产引育种中心南宁530031

【目的】明确努比亚山羊骨形态发生蛋白受体-IB(BMPR-IB)基因多态性与其产羔性状的关联,为山羊育种寻找新的遗传分子标记。【方法】采用DNA池结合PCR产物直接测序技术检测努比亚山羊BMPR-IB基因全部编码区的变异情况,以时间飞行质谱列... 详细信息

【目的】明确努比亚山羊骨形态发生蛋白受体-IB(BMPR-IB)基因多态性与其产羔性状的关联,为山羊育种寻找新的遗传分子标记。【方法】采用DNA池结合PCR产物直接测序技术检测努比亚山羊BMPR-IB基因全部编码区的变异情况,以时间飞行质谱列阵技术对候选SNP位点进行基因分型,并分析BMPR-IB基因多态性与产羔性状(产羔数、初生重和断奶重)的关联性。【结果】努比亚山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位存在A→G碱基突变,内含子1第1664位和内含子9第11344位处存在G→A碱基突变。3个SNP位点(5'UTR 469^(th)、Intron1 1664^(th)和Intron9 11344^(th))存在3种基因型(GG型、GA型和AA型),对应的多态信息含量(PIC)分别为0.37、0.11和0.37,其中Intron1 1664^(th)位点的基因频率和基因型频率处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),5'UTR 469^(th)和Intron9 11344^(th)位点则处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P产羔数和子代平均初生重有所减少,但子代平均断奶重增加;内含子1第1664位碱基由G→A,其GA型母羊比GG型母羊的产羔数和子代平均初生重均有所增加,但子代平均断奶重减轻;内含子9第11344位碱基由G→A,其AA型母羊比GG型母羊产羔数少,但子代平均初生重和平均断奶重均增加。可见,努比亚山羊BMPR-IB基因的3个SNP位点对其产羔性状均无显著影响(P>0.05)。【结论】努比亚山羊BMPR-IB基因存在3个SNP位点(5'UTR 469^(th)、Intron11664^(th)和Intron9 11344^(th)),但对努比亚山羊产羔性状影响不显著,说明BMPR-IB基因对山羊的产羔性状具有一定种属特异性。

关键词：努比亚山羊 BMPR-IB基因 SNP位点产羔性状多态性关联分析

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

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畜牧兽医学报 2020年第7期51卷 1607-1618页

作者：敖叶陈祥周志楠张艳洪磊韦仕南吴雨唐文贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点试验室贵州省动物遗传育种与繁殖重点试验室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵阳550025

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子... 详细信息

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组(P0.05)。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组(P产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。

关键词：黔北麻羊 SMAD1基因卵巢颗粒细胞差异表达产羔性状