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水体中云芝-f21a蓝藻互作机制的初步研究

水体中云芝-F21a蓝藻互作机制的初步研究

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作者：费维成安徽农业大学

学位级别：硕士

蓝藻爆发不仅会使鱼类等水生生物窒息死亡,而且会分泌毒素,直接危害生物生存与人类健康。利用微生物控制水华与传统的物理化学方法相比,具有方法简单、不易引起污染等优点,已成为蓝藻水华治理研究的热点。目前,微生物控藻研究多集中于... 详细信息

蓝藻爆发不仅会使鱼类等水生生物窒息死亡,而且会分泌毒素,直接危害生物生存与人类健康。利用微生物控制水华与传统的物理化学方法相比,具有方法简单、不易引起污染等优点,已成为蓝藻水华治理研究的热点。目前,微生物控藻研究多集中于筛选具有优良特性的溶藻细菌、病毒、真菌,而利用这些微生物溶藻对水体的透明度和水生生态也有一定的影响。近几年发现的一种新型真菌控藻方法可以克服上述生物控藻剂的缺点,为水华蓝藻的防治以及快速去除水体藻毒素提供了一种新的途径。这种方法是利用真菌菌丝体将活体藻细胞包裹并将其完全分解,同时藻溶液也变得透明澄清,然而此种除藻方法机制尚不清楚。本论文利用高效除藻真菌云芝-f21a(Trametes versicolor f21a)为供试菌,通过扫描电镜观察不同时间段的真菌-蓝藻互作的细胞生物学作用过程;利用转录组测序寻找差异表达的基因并进行功能富集分析,并利用RT-PCR及酶活分析的方法对差异表达的基因,特别是分解酶相关基因进行验证;建立云芝-f21a遗传转化体系用于基因功能验证。主要结果如下:(1)利用扫描电镜观察了不同时间段的云芝-f21a菌丝膜与蓝藻共培养体系,观察到在共培养体系中,云芝真菌菌丝形成一种不甚紧密的腔体状结构,这种结构把一部分蓝藻细胞包裹在其中,随着时间的延长,蓝藻细胞变形,直至最后完全消失。(2)对培养0 h、1 h、6 h的真菌-蓝藻共培养体系样品进行真菌转录组测序,分别得到5986250、6290837、5833802个有效的clean reads,其中大约53%的clean reads可以回帖(mapping)到云芝参考基因组上。将mapping上的基因进行注释并进行基因差异分析,结果显示共培养1 h的样品与0 h的样品相比,云芝有1439条基因的表达量显著上调,1981条表达量显著下调;而共培养6 h的样品与0 h的样品相比,云芝有1161条基因的表达量显著上调,1887条下调。对共培养过程中差异表达的基因通过GO term富集分析可以看出:在生物学层面,这些差异表达的基因主要与细胞加工、代谢加工等相关;在细胞组分层面,这些差异表达的基因主要与细胞器组分、高分子复合物有关;在分子功能层面,这些差异表达的基因主要与结合、催化有关。通过KEGG Pathway富集分析可以看出,差异表达的基因主要与细胞加工、环境信息加工、遗传信息加工、代谢有关。在细胞加工层面,差异基因主要参与物质代谢运转、细胞生长和死亡;在环境信息加工层面,差异基因主要参与信号转导;在遗传信息加工层面,差异基因主要参与转录、翻译、化合物的折叠分选降解有关。特别是在代谢层面,差异表达的基因主要参与多糖的合成与代谢、脂类代谢、有害物质的生物降解、能量代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢等。通过GO、KEGG富集分析可以推测,真菌云芝-f21a很可能是通过分解蓝藻细胞的各个组分,然后将各个组分的代谢产物转运到细胞中变成自己生长发育的原材料,云芝的分解酶类以及代谢酶类可能在该新型真菌杀藻过程中起重要作用。对共培养过程中上调的基因进行进一步CAZymes注释,结果显示这些上调的基因中许多是水解酶相关基因,如纤维素酶、木质素酶、锰过氧化物酶、漆酶、α/β水解酶等,这些水解酶相关基因中大约54%的水解酶含有分泌型导肽,意味着超过一半表达上调的分解酶可以分泌到真菌菌丝组成的腔体结构中。对这些水解酶基因进行半定量PCR验证表明,多数差异表达的分解酶基因的累积表达量与蓝藻的降解率呈正相关。主成分分析进一步显示,并不是所有的水解酶基因在真菌降解蓝藻过程中都发挥着相同的贡献,有的水解酶基因如:jgi|Trave1|126211(Cellobiohydrolase I)、jgi|Trave1|30530(GH13)、jgi|Trave1|60067(GH16)、jgi|Trave1|132063(GH18)、jgi|Trave1|58303(α-glucosidase)、jgi|Trave1|138531(laccase)、jgi|Trave1|135205(GH16)、jgi|Trave1|68611(GH72)、jgi|Trave1|131032|(GH5)等在降解蓝藻的过程中可能起主导作用,是主要的分解蓝藻的酶编码基因,酶活的初步分析结果与该分析结论基本一致。(3)云芝-f21a的原生质体制备再生最佳条件为:在PDA培养基上,28℃培养4 d的菌丝,以0.6 mol/L KCl为最佳稳渗剂,在混合酶液(2%cellulase+2%snailase+2%lywallzyme),30℃条件下酶解4 h。原生质体产量可达2.375×10～7个/mL,原生质体再生率达0.74%。采用限制性内切酶介导技术将质粒pAN7-1导入云芝f21a的原生质体获得经PCR验证的

关键词：云芝-f21a 消除蓝藻转录组水解酶分子机理

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真菌Tramete versicolor f21a 降解蓝藻过程中蛋白质组与转录组差异比较

真菌Tramete versicolor F21a 降解蓝藻过程中蛋白质组与转录组差...

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作者：戴薇安徽农业大学

学位级别：硕士

蓝藻水华爆发对水体生态环境具有重大消极影响,严重威胁水生动物和人体的健康。与传统物理和化学方法治理蓝藻相比,微生物方法控制水华的特点为方法简单。近些年发现了一种新型模式的真菌降解蓝藻方法更是优于病毒、溶藻细菌和真菌等以... 详细信息

蓝藻水华爆发对水体生态环境具有重大消极影响,严重威胁水生动物和人体的健康。与传统物理和化学方法治理蓝藻相比,微生物方法控制水华的特点为方法简单。近些年发现了一种新型模式的真菌降解蓝藻方法更是优于病毒、溶藻细菌和真菌等以前控藻方法。此种新型真菌消除蓝藻模式是通过真菌菌丝体形成网状结构“包裹”蓝藻细胞,然后消除蓝藻细胞,然而对此种真菌消除蓝藻细胞的分子机制仍不清晰。本文在课题组前期对真菌***-f21a与蓝藻共培养样品转录组分析以及半定量PCR结果的基础上,先通过定量PCR对表达量差异显著的水解酶基因再次进行验证,然后利用蛋白组学高通量分析再次定量验证,并将蛋白组学定量分析结果与课题组前期转录组测序结果进行关联分析,最后通过试验加以验证。主要结果如下:(1)通过Real-time PCR再次验证显示基因ID为60067(GH16)、135205(GH5)和30530(GH13)等基因在真菌降解蓝藻过程中可能发挥重要作用,这与课题组前期转录结论一致。(2)通过对真菌与蓝藻共培养时间为0 h和12 h的菌膜样品进行蛋白组学定量分析发现,共检测到3754种蛋白质,其中2809种蛋白质能用于定量分析,205个蛋白质表达量显著上调,145个蛋白质表达量显著下调。(3)转录组测序分析与蛋白组学定量分析两者结果关联研究可以看出,3319个蛋白质或者转录本同时在两种高通量测序结果中均能检测到,并且两种测序结果中均显著上调的蛋白质或者转录本数量为72个。差异表达的蛋白质或转录本进行富集分析均显示一些氨基酸代谢和膜代谢相关的代谢通路在云芝消除蓝藻过程中可能起重要作用。(4)通过对转录组和蛋白质分析均表明糖苷水解酶家族成员,如纤维素酶类,在真菌噬藻过程中表达量高。通过试验观察不同浓度的纤维素酶与蓝藻细胞直接作用显示,纤维素酶可使蓝藻细胞在不同的时间内最终完全降解。而同等环境条件下,胰蛋白酶与蓝藻细胞相互作用时,消除蓝藻细胞的能力较差。综合分析表明:纤维素酶类可能在云芝-f21a消除蓝藻过程中起主要作用。

关键词：云芝-f21a 消除蓝藻蛋白组分析转录组分析比较

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